La expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas de la unidad de sangre del cordón umbilical es muy prometedora para la aplicación de HSC en la medicina regenerativa y la terapia de trasplante. Este protocolo utiliza un cóctel de citoquinas combinado con el tratamiento con ácido valproico para expandir rápidamente un gran número de HSC funcionales con características que se asemejan mucho a los HSC primitivos primarios.
Este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células modificadas genéticamente dentro de un período de tiempo que es relevante para los protocolos de modificación genética utilizados actualmente. El protocolo de expansión ex vivo de ácido valproico es relativamente simple y fiable. La purificación de células CD34 positivas con el dispositivo separador celular es altamente reproducible y rápida, lo que permite una rápida recuperación de células CD34 positivas altamente purificadas.
24 horas antes del aislamiento de células positivas CD-34 de sangre del cordón umbilical, preparar el tampón de separación añadiendo dos mililitros de 0,5 MOLar EDTA y 33 mililitros de 7,5%BSA a 465 mililitros de 1X PBS. Mezcle el tampón suavemente y mantenlo durante la noche a cuatro grados centígrados. El día de la purificación, calentar los medios a temperatura ambiente.
Dispensar toda la unidad de sangre del cordón umbilical en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Diluir la sangre con un volumen igual de PBS a temperatura ambiente y mezclar suavemente. A continuación, determine el número de tubos necesarios para procesar toda la unidad de sangre del cordón umbilical.
Agregue 15 mililitros de medios de gradiente de densidad a cada tubo. Dispensar la sangre diluida muy lentamente en la parte superior del gradiente de densidad mientras sostiene el tubo en un ángulo de 45 grados para crear dos capas. Centrifugar el tubo a 400 g durante 30 minutos con una baja velocidad de aceleración y desaceleración.
Después de la centrifugación, las células mononucleares se ubicarán en la capa blanca entre el plasma y las capas de medios de gradiente de densidad. Transfiera cuidadosamente la capa de capa buffy a un nuevo tubo de 50 mililitros. Recoger todas las células mononucleares de la misma unidad de sangre del cordón umbilical en un tubo de 50 mililitros hasta llegar a 25 mililitros.
Añadir 25 mililitros de PBS frío al tubo que contiene 25 mililitros de células mononucleares y mezclar bien. Centrifugar a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 50 mililitros de PBS frío.
Después de esto, retire 20 microlitros de la suspensión celular para el recuento. Utilice un contador de celdas automatizado para contar el número de células manchadas con yoduro de acridina naranja o propidium y calcule el número total de células mononucleares. Luego, centrifuga las células a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.
En primer lugar, mezcle 300 microlitros de búfer de separación con 100 microlitros de IgG humano FCR y 100 microlitros de cuentas magnéticas CD34 para aislar las células CD34 positivas de 10 millones de células mononucleares. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante de un tubo de células mononucleares previamente centrifugadas. Resuspender el pellet en la solución de perlas magnéticas utilizando 500 microlitros por cada 10 millones de células.
Mezclar suavemente e incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, prepare el dispositivo separador de células reemplazando la solución de almacenamiento por el búfer de trabajo y ejecutando un programa de lavado seguido de un programa de enjuague. A continuación, agregue el búfer de funcionamiento del separador de celda fría al tubo que contiene la mezcla celular hasta que el tubo esté completamente lleno.
Centrifugar el tubo a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el búfer de funcionamiento del separador en frío utilizando dos mililitros por cada 10 millones de células. Transfiera la mezcla de suspensión de células de dos mililitros en tubos de 15 mililitros.
Cargue tres juegos de los tubos en el bastidor separador de celdas, que se ha enfriado previamente a cuatro grados centígrados. Un conjunto de tubos contiene MMC, el segundo conjunto de tubos se utilizará para recoger la fracción negativa, y un tercer conjunto de tubos se utilizará para recoger células purificadas CD34 positivas. Cargue el bastidor en el dispositivo separador de celdas y ejecute el programa preestablecido.
Después de esto, centrifugar los tubos que contienen la fracción positiva a 400 g a y cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células purificadas CD34 positivas en un mililitro de medios libres de suero. Luego, utilice un contador de células automatizado para contar las células manchadas con acridina naranja o yoduro propidium.
En primer lugar, prepare un volumen suficiente de medios para placar las células purificadas CD34 positivas a una densidad de 33.000 células por mililitro. Placar las células purificadas CD34-positivas en una placa de 12 pozos a una densidad celular de 50.000 células en 1,5 mililitros de medios por pozo. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono del 5% durante 16 horas.
Añadir ácido valproico a los cultivos de tal manera que la concentración final sea de un milimolar. Continúe cultivando las células en las mismas condiciones durante siete días adicionales. En este protocolo ex vivo, aumenta el número de células madre hematopoyéticas primitivas generadas a partir de células CD34 positivas aisladas de la sangre del cordón umbilical.
El número total de células nucleadas es significativamente mayor en cultivos tratados solo con el cóctel de citoquinas. A pesar del mayor número de células nucleadas totales, el número de células madre hematopoyéticas en los cultivos que reciben el cóctel de citoquinas por sí solo permanece bajo durante todo el período de expansión, en comparación con los cultivos tratados con cóctel de citoquinas y ácido valproico. El mayor número de células madre hematopoyéticas se genera en cultivos tratados con una combinación del cóctel de citoquinas y ácido valproico.
En particular, la mayor expansión se alcanza después de cinco a siete días después del tratamiento con ácido valproico. Este aumento del número de células madre hematopoyéticas se correlaciona con un rápido aumento en el porcentaje de células madre hematopoyéticas, que se destaca dentro de las 24 horas del tratamiento con ácido valproico. Mientras que el aumento en el porcentaje se mantiene durante los primeros cuatro días de cultivo ex vivo, disminuye progresivamente después de cinco a siete días de tratamiento.
Sin embargo, esta disminución se correlaciona inversamente con un aumento en el número absoluto de células madre hematopoyéticas. El rápido aumento del porcentaje de células madre hematopoyéticas en cultivos tratados con ácido valproico se debe a la adquisición del fenotipo CD90. Las células CD34 positivas que expresan el marcador fenotípico CD90 alcanzan casi 40 a 50% de las células expandidas en cultivos ex vivo tratados con el cóctel de citoquinas y ácido valproico durante cuatro días.
La adquisición del fenotipo CD90 se confirma entonces por la expansión ex vivo de las células CD34 positivas altamente purificadas que carecen de expresión del marcador CD90. Dentro de las 24 horas de tratamiento con ácido valproico, casi el 75% de las células expandidas ex vivo expresan CD90. Este fenotipo es altamente retenido durante los primeros cuatro días en estas culturas.
La sangre del cordón umbilical diluido se debe dispensar muy lentamente en la parte superior del gradiente de densidad mientras se mantiene el tubo en un ángulo de 45 grados para crear dos capas distintas. Después de este procedimiento de expansión ex vivo, las células expandidas se pueden inyectar en los ratones sin efectos inmunes e inmunes con deficiencia de mieloablados para probar su funcionalidad y potencial de injerto. Las células expandidas se pueden utilizar para probar una variedad de preguntas con respecto a la biología de HSC humano y ratón y el papel de diferentes genes o actor crítico en la integridad funcional de los HSC.
La funcionalidad del HSC expandido ex vivo de la unidad de sangre del cordón umbilical humano, utilizando esta técnica, pronto se probará en un ensayo clínico en pacientes con neoplasias malignas hematológicas que requieren trasplante de médula ósea alogénico. Esta técnica también nos ha permitido investigar el mecanismo subyacente a la expansión ex vivo con el tratamiento VPA y obtener información sobre la biología de los HSC primitivos.
