The authors have no conflicts of interest to disclose.

1. Enriquecimiento de las células progenitoras hematopoyéticas de sangre entera adulto NOTA: células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 + se pueden purificar a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo sangre del cordón umbilical, material de leucaféresis y la sangre entera utilizando métodos basados ​​centrifugación en gradiente de densidad. El método enumerado aquí utiliza la sangre entera como un ejemplo. <ol><li> El aislamiento de PBMCs de sangre entera: <ol><li> Añadir 4,5 ml de medio de separación de linfocitos al tubo SepMate pipeteando a través del orificio central de la pieza de inserción. </li><li> Diluir la muestra de sangre con un volumen igual de DPBS estériles que contienen 2% de suero humano (v / v). Por ejemplo, diluir 5 ml de muestra con 5 ml de DPBS + 2% de suero humano. </li><li> Añadir la muestra diluida pipeteando hacia abajo el lado del tubo. Tenga cuidado de no verter la muestra directamente a través del agujero central. </li><li> Centrifugar a 1200 xg durante 10 min a TA. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante por encima de la capa de PMBC. </li><li> Recoger la capa de PBMC (nublado) en un nuevo tubo. </li><li> Añadir 15 ml de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) que contiene 2% de suero humano en el tubo y centrifugar a 150 xg durante 10 min a TA con el freno. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de DPBS que contenía 2% de suero humano. Contar el número de células. </li><li> Centrifugar a 690 xg durante 10 min a TA. Eliminar todo el sobrenadante del tubo. </li><li> Resuspender las células en 1 x 10 7 células por 15 ml de de Dulbecco modificado por Iscove medio (IMDM) que contenía 1% de antibióticos (v / v) y 10% de suero humano (v / v). </li><li> Se incuban las células O / N a 37 ° C en el 5% de CO2 antes de aislar las células CD34 +. </li></ol></li><li> La selección positiva de células CD34 + a partir de PBMCs utilizando CD34 multisort Kit: NOTA: trabajo rápido y utilizar soluciones pre-enfriado para fabricar células frío y prevenir tapadode anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado de células no-específica por la instrucción kit. <ol><li> Recoge todas PMBCs en un tubo de 50 ml y contar el número de células totales en el medio. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. Retire completamente todo el sobrenadante. </li><li> Resuspender hasta 10 8 células por 300 l en tampón de talón (DPBS que contenía 0,5% de suero humano (v / v) y EDTA 2 mM). </li><li> Añadir 100 l de FcR Reactivo de bloqueo y añadir 100 l de MultiSortMicroBeads CD34. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en el frigorífico (2-8 ° C). </li><li> Lavar las células mediante la adición de 2 ml de tampón de grano por 10 8 células y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante. </li><li> Resuspender hasta 10 8 células en 500 l de tampón. </li><li> Colocar la columna MACS LS en el campo magnético de un MACS Separador y preparar la columna de lavado con 3 ml de tampón de perla. </li><li> Aplicar la suspensión de células en el center de la columna. Células no marcadas fluirán a través del cual se pueden recoger, si se prefiere. </li><li> Lavar la columna tres veces con 3 ml de tampón de perla. </li><li> Retire la columna del separador y colocarlo en un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de la gota sobre la columna y eliminar inmediatamente las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo en la columna. </li><li> Añadir 20 l de multisort liberación de reactivo por 1 ml de suspensión celular. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el frigorífico (2-8 ° C). </li><li> Añadir 1 - 2 ml de tampón de grano por 10 7 células y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 50 l de tampón de grano por 10 7 células. </li><li> Añadir 30 l de multisort Detener Reactivo por 10 7 células y se incuba durante 15 minutos en el refrigerador. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de talón y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. La derivación de células madre neuronales inducida de células CD34 + <ol><li> Las células CD34 + cultura: NOTA: medio recién preparado se debe utilizar dentro de los 7 días cuando se almacena en el refrigerador. Pérdida significativa de células CD34 se observó después de 24 hr, pero la proliferación significativa de células debe ser perceptible, especialmente después de día 5. Si el número de células disminuye continuamente o no hay proliferación, implica ya sea mala calidad de las células medianas o CD34 y las células no debe ser utilizado para el siguiente paso. <ol><li> + Resuspender las células y la cultura CD34 en CD34 mantenimiento de medio (medio StemSpan SFEM que contiene trombopoyetina humana (TPO, 100 ng / ml), de tipo fms tirosina quinasa 3 (Flt-3) ligando (100 ng / ml) y factor de células madre (SCF, 100 ng / ml), interleucina-6 (IL-6, 20 ng / ml) y la interleucina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) en una placa de 24 pocillos (hasta 3 x 10 5 / pocillo en 1 ml de medio por pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> After 24 horas, recoger las células flotantes y centrifugar las células a 110 xg a temperatura ambiente para deshacerse de las células unidas y restos celulares. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de mantenimiento y CD34 semilla fresca en una nueva placa de 24 pocillos (hasta 1 x 10 5 / pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora durante 5 días adicionales. </li><li> Reemplazar la mitad del medio cada otro día por aspiración cuidadosamente la mitad superior del sobrenadante mientras que las células CD34 + están flotando en la parte inferior de los pocillos (Figura 1A). </li></ol></li><li> Sendai transfección virus: <ol><li> En el día 5, recoger las células CD34 y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en medio fresco a 1 x 10 5 / pocillo en una placa de 24 pocillos en 1 ml de medio. </li><li> Descongelar un kit de reprogramación cytotune-iPS Sendai sumergiendo primero la parte inferior de los tubos en un baño a 37 ° C durante 10 segundos y luego descongelar completamente unt RT. Brevemente centrifugar los tubos y los puso en hielo. Preparar la mezcla de virus Sendai mezclando el volumen recomendado de cada virus que aparece en el certificado de análisis (COA) para el lote correspondiente. Se recomienda MOI 15. </li><li> Añadir la mezcla de virus Sendai a cada pocillo de células CD34. Mezclar los pozos sacudiéndolo suavemente. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Observar la eficacia de transfección después de 24 horas. Observe que los agregados de células y formación de esferas son indicadores para la transfección con éxito (Figura 1B). </li><li> Cambie la mitad del medio transfiriendo cuidadosamente la mitad superior del medio a otro también. Si hay esferas de células en el nuevo bien, añadir la misma cantidad de medio fresco. </li><li> Cambio de medio cada otro día a paso 2.2.6 repetir. </li></ol></li><li> Neural la inducción de células madre: NOTA: Dependiendo de las condiciones de células, a unos 5 o 7 días después de la transfección, las células adherentes monocapa alcanzarán 30 -50% de confluencia (Figura 1C). <ol><li> Retirar los sobrenadantes que contienen células flotantes y esferas y luego añadir 1 ml de medio de progenitor neural (Medio Eagle Modificado de Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12), que contiene suplemento 1x N2, 0,1% (w / v) de albúmina de suero bovino ( BSA), 1% (v / v) antibióticos, 20 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF)) en las células adherentes. </li><li> Opcionalmente, disociar las esferas de células pipeteando suavemente y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de progenitor neural en una nueva placa de 24 pocillos recubierta con Matrigel por instrucción como una copia de seguridad. </li><li> Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia, por lo general después de 1 semana. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir en 1 ml de medio de células madre neurales (medio libre de suero, NSC SFM). Disociar las células utilizando un raspador de células seguidocon la pipeta muy suave. </li><li> Retire las células y sembrar todos ellos en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir otro 1 ml de medio de células madre neurales para hacer 2 ml de medio para cada pozo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambie medio cada otro día. </li><li> Cuando las células alcanzaron 60% de confluencia, disociar y replate las células en relación 1: 3 siguiendo los pasos de los puntos 2.3.4 y 2.3.6. </li></ol></li><li> La congelación de las células madre neurales: <ol><li> Preparar célula madre neural medio de congelación mediante la adición de 20% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) en el medio de células madre neural. Mantenga el medio de congelación en el hielo. </li><li> Disociar las células en una placa de 6 pocillos, con un raspador celular seguido pipeteando suavemente. Contar las células. Centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en medio de células madre neurales a 1 x 10 6 / ml. Añadir el mismo volumen de medio de congelación a las células. </li><li> Añadir 1 ml (5 x 10 5 células totales) de células en un criovial. Congelar las células utilizando un recipiente de congelación Sr. Froster después de la instrucción. </li></ol></li></ol> 3. Neural Diferenciación Celular <ol><li> Células neuronales de diferenciación: <ol><li> Cuando las células madre neurales alcanzan el 80% de confluencia, separar las células madre neurales utilizando una goma de policía y luego disociarse pipeteando suavemente. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de 1 x 10 5 / ml en medio de células madre neurales. </li><li> Para la diferenciación neuronal, la placa de las células en la cubierta de poli-D-lisina / laminina recubierto desliza en placas de 24 pocillos a 1 x 10 5 / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Reemplazar el medio con medio de diferenciación neural (DMEM / F12 que contiene suplemento N2 1x, 1x suplemento de B27, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM de vitamina C, 10 cerebro ng / ml factor neurotrófico derivado (BDNF) y 10 ng / ml de células gliales deriva factor neurotrófico (GDNF)) after 24 hr. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambiar medio de diferenciación neural dos veces a la semana durante 2 semanas. </li></ol></li><li> Diferenciación astroglial: <ol><li> Disociar las células madre neurales con la pipeta. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de células a 5 x 10 4 células / ml. Sembrar las células en placas de 24 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Reemplazar el medio con DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas. Si las células alcanzan la confluencia antes de 2 semanas, replate las células siguientes pasos 3.2.1 y 3.2.2. </li></ol></li><li> La diferenciación de oligodendrocitos: <ol><li> Disociar las células madre neurales con la pipeta. </li><li> Contar las células y semillas de 1 x 10 5 células de recubrimiento 24 y placas de poli-L-ornitina en 1 ml de differenti oligodendrocitosación medio que consiste en DMEM / F12 que contiene suplemento N2, 10 ng / ml de derivado de plaquetas factor de crecimiento-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml de neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), y 3 nM de triyodotironina (T3). Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas. </li><li> Sustituya el medio por DMEM / F12 con suplemento 1xN2 y 3 nM de T3 y cultivar las células para una semana adicional para la proteína básica (MBP) la producción de mielina. </li></ol></li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Reemplace medios con 4% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. </li><li> Desechar PFA y lavar con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBS-T) 3 veces, 5 minutos cada vez. </li><li> Permeabilizar las células con PBS que contenía 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a RT. </li><li> Bloquear las células con PBS-T que contiene 4% de suero de cabra durante 20 min a TA. </li><li> Se incuban las células con Antibo primaria correspondientemuere diluido en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 2 horas a RT o O / N en la habitación fría. </li><li> Lavar las células durante 3 veces con PBS-T, 5 min cada vez. Se incuban las células con los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados con un fluorocromo usando dilución 1: 400 en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 1 hora en un agitador en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS-T que contiene 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min a TA. </li><li> Lavar las células dos veces más con PBS-T durante 5 min cada uno a TA. </li><li> Observar las células marcadas con un microscopio y tomar fotos (Figura 3). </li></ol>

<ol>
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C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34++cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation.">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720 (2013).</li><li>Jin, C. 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The study is funded by NIH intramural funds.

Se proporciona un protocolo detallado para generar directamente las células madre neurales a partir de células progenitoras hematopoyéticas periféricas. En comparación con células de fibroblastos, la sangre periférica humana es más accesible. Utilizando el protocolo presentado, más de 1 x 10 5 células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 positivas, pueden enriquecerse a partir de 10 ml de sangre entera. Aunque la contaminación con plaquetas por lo general no se...

In vitro cultivos neuronales se han utilizado como una herramienta fundamental para estudios de enfermedades neurológicas. Primarios de origen animal (principalmente roedores) los cultivos neuronales 1, 2 y líneas de células neurales humanas derivadas de gliomas u otros tumores son los más comúnmente utilizados en tales estudios. Sin embargo, se ha reconocido que existen diferencias significativas entre roedores y células humanas. Muchos hallazgos basados ​​en roedores no pueden ser traducidos a los seres humanos. Por otra parte, con el rápido desarrollo de análisis de la información genómica masiva y la edición de genes relativamente fácil y la secuenciación del genoma, la tendencia es cada vez más orientado a descubrir la enfermedad genes propensos y delinear sus funciones y roles en enfermedades específicas, lo que hace que los pocos neuronal humano líneas celulares sólo han limitado su uso. En teoría, los cultivos neuronales primarios humanos derivadas de muestras de sistema nervioso del paciente son la mejor opción, pero son imposibles de obtener; meth por lo tanto alternativaSAO son necesarios. En los últimos años, se hayan interpuesto algunos enfoques, con dos que son los más distinguibles. Tras el desarrollo de la técnica de generar células madre pluripotentes inducidas (IPSC) a través del ratón y células somáticas humanas 3, 4, células neurales podría estar más diferenciada de ellos 5-7. Sin embargo, la generación y caracterización de IPSC exige mucha mano de obra, las técnicas, y la entrada de tiempo, a veces incluso prohibitivo. Poco después, otro enfoque fue desarrollado para transformar directamente las células neuronales a partir de células somáticas 8, 9. Como las neuronas resultantes son no proliferativa, limita su aplicación en estudios intensivos y la detección de drogas, que requiere una gran cantidad de células. Para aprovechar las ventajas de ambas técnicas, la derivación directa de la madre neurales / células progenitoras a partir de células somáticas ha sido explorado por varios grupos 10-12, que no pasa por el tedioso proceso de generación y caracterización de IPSC pero todavía Provides un buen número de células madre neurales de diferenciación neuronal después. Hemos demostrado previamente que, tras la introducción de los factores de transcripción Yamanaka en células progenitoras hematopoyéticas, células madre neurales pueden ser generados directamente utilizando una célula progenitora neural seleccionando medio 13. Aquí, se presenta el método en detalle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Material List</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:72px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:171px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">17-829E</td>
			<td style="width:72px;">1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SepMate</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">15415</td>
			<td style="width:72px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Human Serum</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">34005-100</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15240-062</td>
			<td align="right" style="width:72px;">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CD34 MultiSort Kit</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-056-701</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Cellgro</td>
			<td style="width:135px;">46-034-Cl&#160;</td>
			<td style="width:72px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">MACS LS Column</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-042-401</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">StemSpan SFEM Medium</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">9650</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IMDM</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">112-035-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TPO</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-18</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flt-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-19</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SCF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-07</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-6</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-06</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-7&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-07</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IPS Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1378001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:135px;">83.183</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMSO</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D2650</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CryoTube vials</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:135px;">368632</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Mr. Frosty container</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td style="width:135px;">5100-0001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">12400-024</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A2934</td>
			<td style="width:72px;">0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">bFGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-18B</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17504-044</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NSC serum free medium</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1050901</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:208px;">Poly-D-lysine/laminin coated cover slips</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">BD Bioscences</td>
			<td align="right" rowspan="2" style="width:135px;">354087</td>
			<td rowspan="2" style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">cAMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9501</td>
			<td style="width:72px;">300 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A0278</td>
			<td style="width:72px;">0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-02</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">GDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-10</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P4957</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PDGF-AA</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-13A</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NT-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-03</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Shh</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">1314-SH/CF</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">T3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T6397</td>
			<td style="width:72px;">3 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PFA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:208px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:135px;">119-069-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Goat serum</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G9023</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T9284</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5922</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-SOX2&#160; antibody</td>
			<td style="width:171px;">Applied Stemcell</td>
			<td style="width:135px;">ASA0120</td>
			<td style="width:72px;">Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse anti-&#946;III-tubulin antibody</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">G712A</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:208px;">Rabbit anti-GFAP antibody</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4546</td>
			<td style="width:72px;">1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-O4 antibody</td>
			<td style="width:171px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">MAB1326</td>
			<td style="width:72px;">IgM; 1 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11012</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A21042</td>
			<td style="width:72px;">1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D9542</td>
			<td style="width:72px;">1 ug/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells

Enfermedad humana cultivos neuronales específicas son esenciales para la generación de modelos in vitro para enfermedades neurológicas humanas. Sin embargo, la falta de acceso a los cultivos primarios neuronales adultas humanas plantea desafíos únicos. La evolución reciente de las células madre pluripotentes inducidas (IPSC) ofrece un enfoque alternativo para derivar culturas neuronales de fibroblastos de la piel a través de paciente específico IPSC, pero este proceso es laborioso, requiere conocimientos especiales y grandes cantidades de recursos, y puede tomar varios meses. Esto impide la amplia aplicación de esta tecnología para el estudio de enfermedades neurológicas. Para superar algunos de estos problemas, hemos desarrollado un método para obtener células madre neurales directamente de la sangre periférica humano adulto, sin pasar por el proceso de derivación de IPSC. Las células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de sangre periférica humana adulta se cultivaron in vitro y se transfectaron con los vectores de virus Sendai que contienen factores de transcripción Sox2, Oct3/4, Klf4 y c-Myc. Los resultados de transfección en cambios morfológicos en las células que se seleccionan aún más mediante el uso de medio progenitora neural humano que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las células resultantes se caracterizan por la expresión de marcadores de células madre neuronales, tales como nestina y SOX2. Estas células madre neurales podrían diferenciarse aún más a las neuronas, oligodendrocitos astroglia y en medio de diferenciación especificado. Usando muestras de sangre periférica humana de fácil acceso, este método podría utilizarse para obtener células madre neuronales para una mayor diferenciación de las células neuronales para el modelado in vitro de los trastornos neurológicos y puede avanzar en estudios relacionados con la patogénesis y el tratamiento de esas enfermedades.

<html> La calidad de las células CD34 es crítico para el éxito de la transducción de células madre neural. Células CD34 de alta calidad proliferan durante el primer par de días de cultivo y aparecen como no adherente, células homogéneamente redondas, flotando justo por encima de la parte inferior de los recipientes de cultivo (Figura 1). Los resultados de infección exitosas en agregados de células, que se expande a través del tiempo (Figura 1B), mientras que se pueden produci...

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K vistas.  National Institutes of Health.  Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica. 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...