En la medicina regenerativa, un protocolo robusto de diferenciación de células madre pluripotentes hacia un tipo específico de células neurales es una herramienta valiosa. En nuestro caso, estos protocolos fueron muy útiles para estudiar tanto el desarrollo del glioblastoma como la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, primero, la generación de organoides tridimensionales tiene la ventaja de imitar estrechamente el desarrollo fisiológico, y también la producción de neuroesferas calibradas en tamaño a partir de células madre pluripotentes tiene alta reproducibilidad.
El siguiente procedimiento será demostrado por Manon Locatelli, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. 24 horas antes de iniciar el cultivo tridimensional, sustituya el medio hESC por un medio libre de suero complementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Las células deben estar al 60% de confluencia.
Al día siguiente, separar las colonias de hESC como células individuales mediante la eliminación del medio y enjuagar con calcio y PBS libre de magnesio. A continuación, agregue cinco mililitros de solución de disolución enzimática e incubar a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos. Después, recoger las células en medio libre de suero con inhibidor de ROCK 10 micromolar y centrifugar las células a 300 veces g durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, compruebe el tamaño del pellet celular. Retire el sobrenadante y cuente las células en 10 mililitros de medio libre de suero complementado con inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Paralelamente, enjuague la placa de micropocillos con dos mililitros de medio libre de suero por pozo y centrifuga la placa a 1.200 veces g durante cinco minutos para eliminar todas las burbujas con el fin de evitar la formación de neuroesferas.
A continuación, preparar 28,2 millones de células en 12,5 mililitros de medio libre de suero complementado con inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Dispensar 1.000 células por micropocillos. Centrifugar las células a 300 veces g durante cinco minutos y comprobar la repartición homogénea de las células en la placa de micropocillos bajo un microscopio.
Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, examine la placa de micropocillos para comprobar el tamaño de las esferas formadas en cada micropocillos. Transfiera las esferas a una placa de seis pocillos utilizando el medio complementado con un cóctel de inhibición de doble SMAD para promover la inducción neuronal rápida.
A partir de este paso, las esferas se cultivan en rotación a 60 rpm para evitar que se peguen juntas o a la placa. En el primer a cuatro días, cambie el medio cada dos o tres días antes de realizar la inducción neuronal. Desde el cuarto al 11, promover la proliferación de rosetas neuronales derivadas del hESC mediante la adición de EGF y bFGF a 10 nanogramos por mililitro al medio B27 complementado con cóctel de doble SMAD.
Desde el día 11 hasta el 13, cultivar las esferas en B27 medio complementado con 0.5 inhibidor de BMP micromolar. Desde el día 13 hasta el 21, el cultivo de las esferas en el medio B27 complementado con GDNF y BDNF a 10 nanogramos por mililitro y un inhibidor de la gamma-secretasa micromolar. En el día 21, coloque un inserto de placa de cultivo en un pozo de una placa nueva de seis pozos.
Después, añadir un mililitro de medio B27 complementado con factores de crecimiento e inhibidores a cada pozo debajo del inserto de membrana. Posteriormente, placar las esferas en una membrana de PTFE hidrófilo depositada en un inserto de placa de cultivo y cambiar el medio cada dos a tres días para las siguientes tres semanas de diferenciación. Detenga la rotación desde este paso.
La presencia de rosetas indica el inicio de la diferenciación neuronal. Del día 21 al 25, cultiva organoides neuronales humanos en el mismo medio de maduración neuronal. Luego, desde el día 25 hasta el 28, sólo complemente el medio B27 con un inhibidor de la gamma-secretasa micromolar.
Desde el día 28 hasta el 39, deje de agregar el inhibidor de la gamma-secretasa y continúe el cultivo de organoides neuronales humanos en el medio B27 solamente. Después de tres semanas, los organoides neuronales están listos para usarse para la implantación de GIC. En el día cero, amplifica los hESC en la cultura bi-D hasta un 60% de confluencia.
A continuación, reemplace el medio de células madre utilizado para mantener las características de pluripotencia de los hESC por un medio libre de suero que contenga un cóctel de inhibición de doble SMAD para iniciar la inducción neuronal y el inhibidor de ROCK de 10 micromolares para aumentar la tasa de supervivencia de las células durante el paso del día siguiente. En el primer día, prepare la placa de micropocillos con 2,5 mililitros por pozo de medio libre de suero que contenga la misma concentración de inhibidor de ROCK y moléculas de inhibición de doble SMAD. Para diferenciar las células hacia el patrón ventral del tubo neural, agregue SHH y FGF8 a 100 nanogramos por mililitro y dos micromolares alisados agonistas.
Después de añadir el medio, centrifugar la placa a 1.200 veces g durante cinco minutos para eliminar las burbujas de aire de los micropocillos. Una vez que la placa de micropocillos esté lista para usar con medio diferenciador medio, retire el medio de los hESC y lave rápidamente con PBS sin calcio y magnesio. Disociar las colonias en una suspensión de una sola célula añadiendo 7,5 mililitros de solución enzimática recombinante en un matraz T75.
Incubar las células durante dos minutos a 37 grados centígrados y luego añadir 7,5 mililitros de DMEM F12. Posteriormente, recoja la suspensión celular y la centrífuga a 300 veces g durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y cuente las células en el mismo medio utilizado para preparar la placa de micropocillos.
Ajuste el volumen medio para obtener una suspensión celular permitiendo formar neuroesferas que contienen 1.000 células por micropocillos mediante la preparación de 4,7 millones de células en 2,5 mililitros de medio, y añadiéndolo a los 2,5 mililitros anteriores de medio ya colocado en la placa. Para distribuir correctamente las células en cada micropocillos, agita suavemente la placa y centrifuga la placa a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas para generar esferas.
En el segundo día, enjuague suavemente los micropocillos con el medio y transfiera las esferas en una placa de seis pozos tratada con tejido. Coloque las esferas en rotación a 37 grados centígrados y cambie la mitad del medio con un medio fresco cada dos o tres días. En el tercer al día 13, para mejorar la inducción neuronal y convertir a progenitores neuronales con una identidad de cerebro medio, complementar el medio con tres micromolar GSK-3-beta inhibidor.
Divida la muestra en dos nuevas placas de seis pozos tratadas con tejido para reducir la densidad de la esfera y evitar la agregación de la esfera. En el octavo día, comienza la maduración neuronal cambiando a un nuevo medio con factores de crecimiento y cambia el medio cada dos a tres días. En el día 21, coloque un inserto de placa de cultivo en un pozo de una placa nueva de seis pocillos y agregue 1,2 mililitros de medio de maduración neuronal utilizado para la diferenciación de la neurosfera debajo del inserto de membrana.
A continuación, deponga la membrana de PTFE en un inserto de placa de cultivo. Finalmente, para generar el organoide neural, semilla alrededor de 100 neuroesferas bajo condiciones de interfaz aire-líquido en la membrana de PTFE. Detenga la rotación desde este paso y cambie el medio cada dos o tres días hasta que se logre el punto de tiempo de diferenciación requerido.
Aquí está un esquema de un protocolo estandarizado para la generación de organoides neuronales dopaminérgicos. El análisis de inmunofluorescencia de organoides neuronales dopaminérgicos que se muestran en estas imágenes indica que las células inmunorreactivas TH coexpresan Nurr1, un marcador específico de cerebro medio. Estos dos gráficos representan la cinética de la expresión génica TH y Nurr1 evaluada por RT-PCR cuantitativo.
Este es un ejemplo de datos sin procesar registrados con la plataforma MEA. Cada pico se muestra mediante una línea vertical, mientras que el seguimiento restante es ruido. Y esta imagen representa una neuroesfera depositada en el MEA.
Estos gráficos muestran la superposición de picos típicos detectados a partir de los datos sin procesar. La curva negrita negra indica el promedio de las curvas rojas correspondientes. Este trazado ráster muestra las marcas de tiempo asociadas a cada pico detectado.
Los diferentes colores resaltan los diferentes electrodos. Estos protocolos permiten al investigador responder a preguntas sobre la interacción de las células cancerosas con el organoide neural, así como el cribado directo con organoide dopaminérgico.
