Este protocolo permite la detección de mutaciones asociadas al tumor y actualmente complementa los procedimientos quirúrgicos invasivos. Otra fuerza es la capacidad de utilizar este protocolo para monitorear la carga de mutaciones tumorales horas extras. La técnica permite el genotipado tumoral sin necesidad de biopsia de tejido quirúrgico real, que es particularmente útil para tumores en lugares desafiantes, como el tronco cerebral con acceso restringido a los tejidos.
En ausencia de biopsia repetida, los datos moleculares longitudinales no están disponibles para complementar la RMN. El monitoreo digital de PCR facilita un suplemento molecular al diagnóstico, lo que permite un proceso de toma de decisiones de tratamiento más informado. Métodos similares se pueden utilizar para detectar la expresión de genes en un sistema particular, con sondas convencionales Fluo-4 y quencher-linked pero con una mayor sensibilidad que con la PCR cuantitativa.
Antes de comenzar el procedimiento de PCR digital de gotas, limpie el espacio del banco y el equipo con 10% de lejía y 70% de etanol y vórtice suavemente y centrifugar brevemente todos los reactivos, excepto el aceite estabilizador de gotas. Confirme que el cilindro de gas nitrógeno comprimido está unido al instrumento de generación de gotas y que el tanque de cilindros se establece en 90 libras por pulgada cuadrada. Y 38 microlitros de mezcla de reacción PCR digital directamente en la parte inferior de cada pozo de una tira de tubo PCR de ocho pozos, eliminando cualquier burbuja con una punta de pipeta limpia.
Añadir 12 microlitros de muestra de ADN preamplificado en triplicado a los pozos apropiados de la tira de tubo. Pipetear suavemente el volumen completo 10 veces para mezclar la mezcla de reacción con la muestra de ADN y pipetear el volumen completo de cada pozo en los canales A a H correspondientes de un chip de instrumento generador de gotas. Inserte una nueva tira de tubo PCR en el instrumento de generación de gotas y escanee el ID de chip del instrumento generador de gotas en el software del ordenador del instrumento.
A continuación, haga clic en Iniciar la ejecución para comenzar a colocar muestras. Cuando se complete la gotletización, retire la tira del tubo PCR y aplique las tapas de la tira de tubo. Transfiera la tira de tubo a un ciclor térmico y equilibre el tubo con otra tira de tubo que contenga 80 microlitros de agua por pozo.
A continuación, ejecute el ciclor térmico en las condiciones de ciclo térmico adecuadas. Sustituya las tapas de las tiras por tapas de alta velocidad. Cuando el ciclo térmico esté completo, transfiera la tira de tubo al instrumento de cuantificación, haga clic en Configurar un funcionamiento en el software de instrumentos y coloque la tira de tubo en el instrumento de cuantificación.
Coloque el escudo metálico encima de un nuevo chip de instrumento de cuantificación, escanee el ID de chip en el instrumento e inserte el chip en la máquina. Cierre la tapa del instrumento. En el software del ordenador, escriba un nombre para la ejecución de PCR digital y para cada uno de los ocho canales, seleccione Modo rápido y haga clic en Iniciar para comenzar la cuantificación.
Para analizar los datos espectrales sin procesar, inicie el software de analista y abra los archivos fcs. En la vista de análisis, seleccione intactos. En la vista de ejemplo, haga clic en los cuadros situados junto a cada uno de los ocho ejemplos.
El software trazará las señales para los alelos mutantes y salvajes a lo largo del eje x e y respectivamente. Utilice la función de matriz calculada para aplicar la compensación espectral en las gotas intactas, según los instructores de los fabricantes y ajustar la configuración del eje en las opciones del eje. Establezca el eje x en un mínimo de cero y un máximo de 30.000 y el eje y en un mínimo de menos 5.000 y un máximo de 10.000.
Cuando se hayan identificado los clústeres de gotas, ajuste el eje para reducir el espacio vacío en el gráfico. Seleccione la muestra correspondiente al ADN genómico del tejido tumoral de control positivo para establecer las puertas de tipo mutante y salvaje negativas, asegurando que los racimos sean distintos y fáciles de identificar. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Aplicar todos los ajustes a las muestras seleccionadas para aplicar la configuración de puerta para el control positivo a todas las muestras.
En la vista gráfica, haga clic en varios ejemplos para ver los trazados de todas las muestras seleccionadas y exportar la imagen como un archivo tif. A continuación, en Espacio de trabajo, seleccione Exportar análisis y guarde el archivo de datos analizado como un archivo csv. Aquí, se muestran resultados representativos para una detección exitosa de una mutación en un plasma preamplificado y ADN libre de células de líquido cefalorraquídeo de dos niños con gliomas difusos de línea media.
En este experimento, se puede observar una separación clara entre los racimos de tipo mutante y salvaje a lo largo del eje x e y respectivamente. Los grupos robustos de tipo salvaje indican que la extracción de ADN libre de células tuvo éxito porque el ADN de la plantilla está presente. Para estos pacientes, los grupos mutantes muestran una frecuencia alélica mutación de 1,6 y 39,32 por ciento para las muestras de plasma y líquido cefalorraquídeo respectivamente de acuerdo con el estado de mutación tumoral, según lo confirmado por el análisis genómico del tejido tumoral biopsiado.
El control negativo, por otro lado, muestra cero gotas mutantes y cero de tipo salvaje que indican que no hubo contaminación de la mezcla de reacción PCR. El ADN genómico del tejido tumoral de control positivo muestra que la mutación se detecta a la frecuencia alélica esperada para la muestra tumoral seleccionada. La ausencia de detección de mutaciones dentro del plasma puede no significar que un paciente es de tipo salvaje para la mutación de interés a medida que se producen falsos negativos.
Por ejemplo, en este paciente, aunque no se detectó la mutación de interés, el estado de la mutación se confirmó mediante un análisis genómico del tejido tumoral. El PCR es una técnica muy sensible que exige una descontaminación frecuente del área de trabajo y del equipo para evitar la adquisición de datos falsos positivos.
