Este protocolo, el ensayo de invasión in vitro, es una herramienta útil para medir cuantitativamente una capacidad de líneas celulares capaces de migrar a través de una matriz rica en proteínas y pasar a través de una membrana porosa, en un proceso similar a las primeras etapas de la invasión de células cancerosas. Estas líneas celulares pueden ser alteradas genéticamente con el fin de expresar en exceso un gen o tener una expresión reducida de un gen con el fin de determinar si ese gen desempeña un papel en la migración celular o invasión celular. Muchos cánceres agresivos implican cambios drásticos en el comportamiento celular, incluyendo el aumento de la migración y la invasión.
Así que este ensayo de invasión in vitro puede permitirnos entender mejor los genes y otros factores involucrados en este proceso. Para comenzar este procedimiento, aumente las células tumorales mamarias de ratón adherentes en un matraz T25 a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad hasta que sean 70%a 90%confluentes para el primer día del experimento. Recupere las inserciones de la cámara Boyden del almacenamiento y transfieralas a una campana de cultivo celular a temperatura cálida a ambiente durante 20 minutos.
Utilice tres inserciones para generar datos estadísticamente válidos para cada línea de celda para cada experimento. Y luego agregue 500 microlitros de los medios DMEM precalejados libres de suero a las inserciones para que la membrana porosa y el gel estén hidratados en ambos lados. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 100% de humedad durante al menos dos horas.
Después de esto, preparar las células mediante la eliminación de los medios de crecimiento y enjuagar las células con cinco mililitros de HBSS. Retire el HBSS y añada un mililitro de solución EDTA 0,25%. Incubar a 37 grados centígrados durante uno a cinco minutos o hasta que las células aparezcan redondeadas o muestren signos de desprendimiento.
A continuación, toque suavemente en el matraz para separar todas las células. Vuelva a suspender las células en cinco mililitros de DMEM con 10%FBS. Y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.
Centrifugar las células y 1000 veces g durante cinco minutos para peletizar suavemente las células. Retire el medio y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de DMEM sin suero. Repita el proceso de centrifugación y re-suspensión dos veces adicionales para un total de tres lavados.
Después de esto, re-suspender a fondo las células en los últimos cinco mililitros de DMEM libre de suero y asegurarse de que no hay grumos de células. Utilice un hemocitoómetro para determinar la concentración celular asegurándose de contar solo las células viables. Y diluir la suspensión celular a 50.000 células por mililitro en cinco mililitros de DMEM libre de suero.
A continuación, retire el plato con las inserciones de la incubadora y aspire suavemente el medio de un inserto. Levante el inserto y aspire el medio del pozo. Trabajando rápidamente, agregue el quimioatractant a la cámara inferior.
Coloque el inserto en el pozo, y para un plato de 24 pozos, agregue 500 microlitros de la suspensión celular a la plaquita. Asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes a ambos lados de la membrana. Devuelva el plato a la incubadora de cultivo celular durante 22 horas.
Después de 22 horas, prepare una solución de 1%paraformaldehído y una X PBS para fijación. En un plato limpio de cultivo celular de 24 pozos, agregue un mililitro del fijador a los pozos individuales para que haya un pozo para cada plaquita. A continuación, preparar la solución de tinción de 0,1% violeta cristalino en una solución de PBS con 10% de etanol.
Añadir un mililitro de esta solución de tinción a un pozo limpio para cada plaquita. Con fórceps, retire cada plaquita de una en una. Coloque un hisopo de algodón estéril dentro de cada inserción y frote el lado superior de la membrana para eliminar las células no+mibres.
Repita este proceso con un segundo hisopo de algodón. A continuación, retire los medios restantes del interior de la plaquita y agregue 750 microlitros de PBS para lavar las células separadas. Retire el PBS y repita el lavado con PBS fresco.
A continuación, coloque la plaquita en un fijador que contenga un bien para fijar las células migradas en la parte inferior de la membrana. Repita este proceso para todas las plaquitas y deje que las plaquitas se arreglen durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, retire cada plaquita de uno en uno de su pozo y lávela con 750 microlitros de PBS.
Coloque la plaquita en una solución de tinción que contenga bien y déjela durante 15 minutos para manchar todas las células migradas y fijas. A continuación, retire las plaquitas y sumerjalas en un vaso de precipitados que contenga agua destilada hasta que el agua que sale de la plaquita esté clara. Retire el exceso de gotas de agua y coloque la plaquita de lado sobre un pedazo de papel de filtro.
Deje secar las plaquitas al aire. Prepare la membrana para la toma de imágenes etiquetando un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio para cada plaquita y colocando una pequeña gota de aceite de inmersión del microscopio en el centro de cada diapositiva. Usando un bisturí, corte alrededor del perímetro de la membrana en el interior del inserto de plástico para separar la membrana.
Utilice fórceps para quitar la membrana y colóquela encima de la gota de aceite en la diapositiva etiquetada. Con un microscopio compuesto, vea las células cinco veces, 10 veces o 20 veces el aumento. Para la cuantificación, tome varias imágenes no superpuestas a una ampliación 10 veces mayor.
Determine el número total de células o células invasoras por área para todas las muestras. Para cada experimento, realice cada condición en el ensayo con tres inserciones de réplica y repita varias veces para obtener resultados estadísticamente útiles. En este estudio, la invasión in vitro a través de una matriz proteica se utiliza para evaluar los fenotipos agresivos en los comportamientos celulares oncogénicos de las células tumorales mamarias de ratón con expresión alterada de la proteína del dedo de zinc, Zc3h8.
Los niveles más altos de expresión de Zc3h8 se observan en las líneas celulares tumorales o por la expresión mediada por el promotor desde un plásmido, lo que resulta en tasas rápidas de proliferación celular, migración rápida, crecimiento en entornos 3D y mayor invasión dentro del ensayo de invasión in vitro. Por el contrario, la disminución de la expresión por construcciones de arneses de agua da lugar a una proliferación, migración e invasión menos agresivas. Mientras que la invasión celular disminuye al derribar el ARNm de la expresión Zc3h8, esa invasión se rescata cuando se rescata la expresión.
La técnica de ensayo de invasión in vitro es extremadamente útil, ya que es un enfoque rápido, barato, flexible y relativamente fácil para estudiar el comportamiento celular. Las células cultivadas en cultivo son fáciles de manipular genéticamente. Incluso se pueden analizar para detectar mutaciones específicas.
El sistema de invasión in vitro también permite el análisis de inhibidores de moléculas pequeñas, así como agentes biológicos como micro ARN por sus efectos sobre la migración celular y la invasión. Este ensayo también incluye una gran flexibilidad, lo que permite la alteración del contenido proteico de la matriz, el tamaño de los poros y el quimioatractant.
