La inmunoprecipitación de ARN en tándem seguida de la secuenciación, o RIPiT-Seq, es un método para identificar qué regiones de ARN están unidas por un par particular de proteínas de unión al ARN. La ventaja más singular de RIPiT es su capacidad para apuntar a dos proteínas diferentes en dos purificaciones. Esto proporciona una manera poderosa de enriquecer para un complejo de proteínas de ARN compositivamente distinto de otros complejos.
Además, RIPiT-Seq es independiente de la reticulación UV, y se puede aplicar a muchas proteínas que actúan sobre el ARN sin unirlo directamente. Si bien este método no se extiende directamente hacia la terapia o el diagnóstico, las proteínas de unión al ARN y el procesamiento de ARN se han asociado con varias enfermedades como las neuropatías y el cáncer. RIPiT-Seq proporciona una herramienta para estudiar las funciones de las proteínas de unión al ARN ligadas a la enfermedad.
RIPiT-Seq requiere un sistema en el que se pueda expresar una proteína etiquetada con epitopo. Sólo se ha probado en células HEK293, y es más susceptible al cultivo celular. Sin embargo, ahora con nuestra capacidad de etiquetar proteínas usando CRISPR, RIPiT-Seq puede ser aplicable a diversos sistemas modernos.
El éxito de RIPiT depende de dos inmunoprecipitaciones eficientes, por lo que será fundamental optimizar las condiciones de inmunoprecipitación para el anticuerpo que se utiliza. Además, trabajar con ARN requiere las precauciones adecuadas, por lo que se deben utilizar reactivos libres de RNase durante y después de la extracción de ARN. Demostrando el procedimiento estará Lauren Woodward, una estudiante graduada en mi laboratorio.
Comience lavando las células monocapa suavemente con 15 mililitros de PBS refrigerado por placa de 15 centímetros. Luego raspa las células en 30 mililitros de PBS y recógelas en un tubo cónico de 50 mililitros. Pele el líquido de las células centrifugando a 400 g durante 10 minutos a 4 grados Centígrados, y deseche el sobrenadante.
Agregue cuatro mililitros de tampón de lysis hipotónica helada y utilice una pipeta P1000 para volver a suspender las células. Transfiera el izado a un tubo de cinco mililitros e incubar sobre hielo durante 10 minutos. Coloque el izado en un baño de hielo y sonice de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
A continuación, añada 108 microlitros de cinco molares de cloruro sódico para ajustar la concentración de sal a 150 mililitros. Luego, centrifugar el licato a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y recoger 20 microlitros del sobrenadante para el análisis de manchas occidentales. Pre-lavado FLAG agarrose cuentas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y aplicar el sobrenadante restante a 750 microlitros de cuentas en un tubo de cinco mililitros.
Incubar las cuentas de agarosa FLAG con el extracto de la célula durante una a tres horas a cuatro grados Centígrados con una mezcla suave. Después de la incubación, pele el descarte de las cuentas por centrifugación a 400 g durante un minuto a cuatro grados Celsius, y recoger 20 microlitros del sobrenadante para el análisis de manchas occidentales. Deseche el sobrenadante restante y lave las perlas resusppendándolas en cuatro mililitros de tampón de lavado iso.
Pele las perlas de nuevo y retire el sobrenadante. Diluir RNase I en 750 microlitros de iso wash buffer de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y añadirlo a las cuentas de agarosa FLAG. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados con una mezcla suave, y luego peletizar las cuentas por centrifugación.
Recoger 20 microlitros de sobrenadante para el análisis de manchas occidentales, y descartar el resto. A continuación, lave las perlas con el tampón de lavado iso como se describió anteriormente. A continuación, realice la elución de afinidad añadiendo 375 microlitros de tampón de elución a las cuentas, y agitando la mezcla suavemente a cuatro grados centígrados durante una a dos horas.
Después de la incubación, pele el cordón de las cuentas y recoger una alícuota de 15 microlitros de la elución para el análisis de manchas occidentales. Mientras la elución de afinidad está en marcha, realice la conjugación magnética de anticuerpos de cuentas. Comience lavando 50 microlitros de cuentas magnéticas en un mililitro de tampón de lavado iso.
Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de conjugación y añadir la cantidad adecuada de anticuerpos. Luego, incuba las cuentas durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Lave las perlas magnéticas dos veces con tampón de conjugación y resuspender las perlas en 375 microlitros de tampón de dilución RIPiT.
Almacene las cuentas sobre hielo hasta la inmunoprecipitación. Aplique la elución de afinidad FLAG a las perlas magnéticas acopladas a anticuerpos e incubar con una mezcla suave durante una a dos horas a cuatro grados Centígrados. Captura las perlas magnéticas con un imán y recoge 15 microlitros de sobrenadantes para el análisis de manchas occidentales.
A continuación, lave las cuentas siete veces con el tampón de lavado iso. Proceda con la elución de desnaturalización resuspendiendo las perlas magnéticas en 100 microlitros de tampón de muestra transparente e incubando la suspensión sobre hielo durante 10 minutos. Durante la incubación, deslice periódicamente las cuentas para resuspenderlas.
Captura las perlas magnéticas en un imán y recoge 15 microlitros de elución para el análisis de manchas occidentales. Transfiera la elución restante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para extraer el ARN, agregue 320 microlitros de agua libre de RNase y 400 microlitros de alcohol isoamilo fenol-cloroformo a la elución RIPiT.
Vórtice la mezcla y luego centrifugarlo a 12.000 g durante cinco minutos. Recoger 350 microlitros de la fase acuosa en un tubo separado. Añadir acetato de sodio, cloruro de magnesio, glucógeno y etanol a la muestra recogida e incubar la mezcla durante la noche a 20 grados Celsius negativos.
Al día siguiente, pele el ARN por centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y lávelo en 70%etanol. Después del lavado de etanol, tratar el ARN con T4 polinucleótido quinasa, o PNK, sin ningún ATP, y realizar la purificación de fenol-cloroformo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Resuspender el ARN limpio en 4,5 microlitros de agua sin RNase.
Para cuantificar el rendimiento del ARN, radioetiquete el ARN con PNK y los ATP etiquetados con PNK de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Utilice una escalera de ADN de rango bajo y un oligo sintético de 20 a 40 nucleótidos para estándares de tamaño y cantidad. Resuelva el ARN etiquetado en un gel de 26%urea-poliacrilamida.
Seque el gel de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y exponga el gel a una fosfobancia hasta que se detecte una señal adecuada. Esta técnica se ha utilizado para investigar las interacciones del complejo de unión de exones o EJC. El análisis de manchas occidentales de proteínas purificadas de cada paso importante del procedimiento RIPiT muestra que el EJC purificado contiene EIF4A3 y MAGOH.
El control negativo, HNRNPA1, no se detecta en la elución. La fuerza de la señal de huella de ARN se correlaciona con la cantidad de interacción con la proteína de ARN. Se observa una huella más fuerte cuando se realizó RIPiT en células tratadas con puromicina, lo que aumenta la ocupación de LA ÉRH en el ARN.
Para garantizar que el RIPiT ha sido eficaz, es importante probar la eficiencia de la IP por western blot. También es importante evaluar la cantidad y la calidad del ARN antes de proceder con secuenciación profunda. En 2018, el laboratorio de Singh utilizó con éxito esta técnica para purificar dos variaciones composicionalmente distintas del complejo de unión de exones e identificar patrones de unión de ARN.
Si los investigadores optan por detectar huellas de ARN con autoradiografía, se deben seguir todos los procedimientos y protocolos adecuados de seguridad radiológica.
