Este protocolo es adecuado para la producción de diterpenoides purificados que se pueden utilizar para diferentes análisis aguas abajo y se pueden personalizar para una gama de diferentes objetivos de metabolitos. La principal ventaja de este método es que es un método simple y barato para producir cantidades de miligramos de metabolitos especializados. Mediante el intercambio de los genes y enzimas utilizados para la coexpresión, este método se puede modificar para producir otros terpenoides, incluyendo monoterpenoides y sesquiterpenoides, así como otras clases de metabolitos como flavonoides.
Para la producción metabólica diterpenoides y la transformación, comience por calentar las células de E. coli químicamente competentes sobre hielo. Cuando el cultivo se haya descongelado, añada 25 microlitros de células competentes por construcción a un microtubo refrigerado de 1,5 mililitros y añada 1 microlitro de 100 nanogramos por solución de microlitro de cada construcción utilizada para la coexpresión. Incubar las mezclas sobre hielo durante 30 minutos con una mezcla suave cada 10 minutos raspando los tubos a través de un portatubos.
Al final de la incubación, el calor impacta las mezclas celulares a 42 grados centígrados durante un minuto antes de volver a colocar las células sobre hielo durante al menos dos minutos más. A continuación, agregue 200 microlitros de 37 grados centígrados de SOC medio a los tubos. E incubar las culturas durante una hora a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto.
Al final de la incubación, agregue aproximadamente 10 cuentas de vidrio autoclaves y 100 microlitros de células a una placa de agar de caldo de égeni calentada de 37 grados centígrados con los antibióticos apropiados. Y agitar la placa horizontalmente con la tapa en su lugar para distribuir uniformemente las células. Luego, toque suavemente las cuentas de vidrio en un contenedor de residuos e incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche, recubiertas de lado de la superficie hacia abajo.
Al día siguiente, retire la placa de la incubadora. Agregue 5 mililitros de medio de caldo de égenido recién preparado con los antibióticos apropiados a un tubo de vidrio estéril de 15 mililitros con una tapa transpirable de plástico por cultivo planificado de 1 litro, y utilice una punta de pipeteo para recoger colonias individuales transformadas de E. Coli de la placa de agar. Agregue una colonia escogida a cada uno de los tubos de 15 mililitros preparados y tape cada tubo con la tapa de plástico transpirable que lo acompaña.
Luego, coloque los pequeños cultivos de E. coli en una incubadora de temblores de 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas. Al día siguiente añadir 100 mililitros de 10x PBS a 900 mililitros de caldo excelente en un matraz de 1 litro por pequeño cultivo con los antibióticos adecuados. Y coloque los matraces a 37 grados centígrados y 140 rotaciones por minuto durante aproximadamente 30 minutos.
Cuando el caldo es excelente, agregue todo el volumen de 5 mililitros de cada cultivo de inoculación a un matraz de cultivo de 1 litro por cultivo. Y coloque los matraces en la incubadora de agitación a 140 rotaciones por minuto durante aproximadamente 3 horas. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,6, reduzca la temperatura de la incubadora a 16 grados centígrados.
Una vez que la incubadora se haya enfriado, añadir 1 mililitro de un IPTG molar, 1 mililitro de riboflavina recién preparado y 1 mililitro de 150 gramos por litro recién preparado a cada cultivo. Para la producción de diterpenoides, añadir 25 mililitros de un piruvato de sodio molar a cada cultivo para asegurar una formación de precursor suficiente. Luego, incubar los cultivos a 16 grados centígrados y 140 rotaciones por minuto durante 72 horas, añadiendo 25 mililitros de piruvato de sodio diariamente a los cultivos apropiados.
Para la separación y purificación de metabolitos, asegure un embudo separador sobre un soporte de anillo en una campana de humo. Y coloque un contenedor de residuos debajo del embudo. Vierta 500 mililitros de una solución 50/50 de acetato de etilo y hexanos en el embudo separador.
Y añade 500 mililitros de la cultura de coexpresión transformada de E.coli de interés en el embudo. Coloque el tapón de vidrio en el embudo y agite el embudo de 5 a 10 veces para mezclar el cultivo con el disolvente de extracción, abriendo con frecuencia el espiga mientras el embudo está boca abajo y apunte hacia la campana de humo para desgasar el embudo. Después de una segunda ronda de temblores y desgasificación como se acaba de demostrar, coloque el embudo erguido en el soporte del anillo durante aproximadamente un minuto.
Cuando la capa de disolvente superior se haya separado de la capa de cultivo acuoso, retire el tapón y drene la capa E.coli en un vaso de residuos, conservando la capa de disolvente dentro del embudo. A continuación, repita la extracción con los 500 mililitros restantes del cultivo utilizando los mismos 500 mililitros de disolvente utilizados para la primera extracción, antes de drenar el disolvente que contiene los metabolitos extraídos en un matraz limpio. Aquí, se muestra nuestro cromatografía de gases representativo-espectrometría de masas cromatograma de productos típicos de enzimas extraídas.
Los subproductos menores comúnmente observados incluyen cloramphenicol y los derivados indol oxindole y pivalaldehído indol. Después de la purificación de diterpenoides a través de la cromatografía de columna de sílice, se pueden obtener tres compuestos de dolabralixina, cuantificados en función de una curva estándar utilizando el esclareol diterpenoides. La cromatografía de sílice es ideal para lograr una alta pureza de los compuestos diana.
Dado que permite la preparación simple de olefinas diterpenas y derivados oxigenados y elimina fácilmente el principal oxindole contaminante, que se conserva en la matriz de sílice. Además, la coexpresión de los genes de la vía terpenoides se puede utilizar para producir diterpenoides en N.Benthamiana, lo que resulta en la producción de dolabradiene y 15, 16 epoxydolabe. Los disolventes utilizados durante la extracción deben optimizarse para las propiedades químicas físicas de los metabolitos de interés y no deben mezclarse con agua para mantener dos capas distintas.
Después de este procedimiento, los metabolitos purificados se pueden utilizar para el análisis posterior, incluyendo análisis estructurales y ácidos antibióticos. Esta técnica permitió el descubrimiento de nuevos diterpenoides, incluidos los que se muestran aquí, permitiendo que estos metabolitos fueran analizados por su estructura química y nuevas biactividades. Tome precauciones cuando utilice disolventes orgánicos en un embudo separador.
Asegúrese siempre de desechar los residuos biológicos de acuerdo con las normas de seguridad de su laboratorio.
