Con este protocolo de imagen de difusión, es posible investigar los cambios microestructurales en el hipocampo de una rata con una lesión cerebral traumática leve que de otro modo no son visibles en la resonancia magnética anatómica. Esta técnica puede detectar alteraciones en el cerebro después de un traumatismo leve y difuso que no se puede detectar con TC o resonancia magnética anatómica. Esta técnica facilita el seguimiento del proceso de recuperación después de sufrir una lesión cerebral traumática leve de una manera objetiva y cuantitativa.
Esta técnica de difusión de imágenes y análisis también se puede aplicar en otros trastornos que afectan al cerebro, como la demencia y la esclerosis múltiple, no sólo en estudios preclínicos, sino también en humanos. En este protocolo, es importante que la calidad de los pasos de corrección y escaneos de difusión sea alta, por lo que se sugiere la orientación de técnicos y analistas experimentados. Coloque al animal en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en una rata Wistar H de 12 semanas de edad e inserte un catéter en una vena lateral de la cola.
Inyectar 100 microlitros de 2%lidocaína localmente en el cuero cabelludo afeitado y desinfectado y hacer una incisión de línea media para exponer el cráneo. Usa unas tijeras pequeñas para eliminar cualquier exceso de membranas y frota un bastoncillo de algodón a través del cráneo hasta que el periosteo ya no esté presente, luego usa una gota de pegamento de tejido para unir un diámetro de 10 milímetros, un disco metálico de tres milímetros de espesor aproximadamente 1/3 delante y 2/3 detrás del bregma. Para la inducción de lesiones cerebrales traumáticas, coloque la rata en una cama hecha a medida con un colchón de espuma de una constante de resorte específica y coloque la rata directamente debajo de un tubo de plástico transparente con un peso de latón de 450 gramos con el casco lo más horizontal posible.
Tire del peso hasta un metro. Con un segundo experimentador presente, suelte el peso y haga que el segundo experimentador mueva a la rata lejos del tubo inmediatamente después del impacto para evitar una segunda lesión. Tire suavemente del casco del cráneo y use una gasa para detener cualquier sangrado.
Cierre la piel con una sutura y aplique gel de analgesia local a la incisión. Coloque la rata en el lecho de un escáner de tomografía computarizada y administre una tomografía computarizada de dosis baja de uso general para descartar fracturas de cráneo, luego coloque la rata en una jaula limpia en una almohadilla calefactora de 37 grados Celsius con monitoreo hasta la recumbancia completa antes de devolver al animal a su jaula. Antes y un día después de la inducción del trauma, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en el animal experimental y coloque el animal en el lecho del escáner de RMN en una posición de cabeza y propensa.
Deslice la bobina de volumen de cuadratura sobre la cabeza y avance la cama del escáner en el orificio del escáner. Para garantizar un posicionamiento correcto, obtenga un escaneo de exploración de 3 planos por defecto. Cuando termine el escaneo, cargue el escaneo en la pantalla de la imagen y asegúrese de que la cabeza esté recta y que el cerebro esté colocado en el centro del imán y la bobina.
Adquiera imágenes ponderadas en T2 utilizando la configuración predeterminada, excepto el campo, la vista y el tamaño de la matriz, que deben ajustarse a una resolución en plano más alta de 109 por 109 micrómetros. Abra el Editor de geometría y coloque el paquete de sectores en la posición correcta, incluido el bulbo del cerebro y el cerebelo y cargue tres nuevas secuencias de ecoplanar, ponderadas por difusión y de eco-eco desde la carpeta B_diffusion en el protocolo de control de escaneo. Adquiera imágenes ponderadas por difusión con la configuración predeterminada y abra la pestaña Editar análisis.
Establezca la orientación de la rebanada en axial y el número de rodajas en 25 para lograr un grosor de rebanada de 500 micrómetros y una distancia de corte interna de 600 micrómetros y enmendar la dirección de lectura en la izquierda-derecha. En la pestaña Geometría, ajuste los parámetros geométricos y ajuste el campo de visión y el tamaño de la matriz a 105 por 105 para garantizar una resolución de 333 por 333 micrómetros. Haga clic en la pestaña Difusión de la pestaña Investigación para cada una de las tres conchas de difusión y ajuste el número de direcciones de difusión a 32 para el primer vaciado, 46 para el segundo vaciado y 64 para el tercer vaciado.
Cambie el número de imágenes B0 a cinco para el primer vaciado, cinco para el segundo vaciado y siete para el tercer vaciado, y ajuste las direcciones de degradado con archivos de dirección de degradado personalizados. Ajuste el valor B por dirección a 800 segundos por milímetro cuadrado para el primer proyectil, 1,500 segundos por milímetro cuadrado para el segundo vaciado, y 2.000 segundos por milímetro cuadrado para el tercer vaciado, luego abra el Editor de geometría y coloque el campo de visión entre el bulbo y el cerebelo que contiene solo el cerebro para reducir el tamaño y el tiempo de escaneo. Al finalizar el protocolo de escaneo, transfiera al animal de la cama del escáner a una jaula limpia con una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius con monitoreo hasta la recumbencia completa.
Para el procesamiento de imágenes por RMN de difusión, cargue las imágenes en MRtrix3 y realice la corrección de ruido y la corrección de timbre de Gibbs en las imágenes ponderadas por difusión en el programa de software. Convierta las imágenes corregidas ponderadas por difusión en la imagen T2 al formato NIFTI como se indica. Para realizar la corrección de las distorsiones de imagen de ecoplanar, movimiento y corriente de peluche, en el menú Plug-ins de ExploreDTI seleccione Corrección para las distorsiones EC/EPI de movimiento del sujeto y seleccione el archivo de datos de difusión preprocesado.
Para calcular las métricas de imágenes de tensores de difusión para cada rata, haga clic en Plug-ins y Exporte cosas a NIFTI y, a continuación, seleccione los mapas paramétricos del modelo de imágenes de tensores de difusión y exporte los mapas paramétricos para los modelos de integridad del tracto de materia blanca y curtosis. Para crear un archivo de máscara para el hipocampo de cada rata, cargue la imagen de anisotropía fraccionaria de la rata en el visor MRtrix y haga clic en el botón más para crear una nueva región de interés. Para extraer las métricas de difusión del hipocampo de la rata, importe el archivo de máscara creado en el software AMIDE y abra los mapas paramétricos y la imagen de máscara de la rata.
Para agregar la región de interés del archivo de máscara a AMIDE, seleccione la imagen del archivo de máscara, haga clic en Editar, Agregar región de interés e isocontour 3D y asigne un nombre significativo a la región de interés. Haga clic en la región de interés que se muestra en la imagen de máscara y confirme que este volumen solo debe contener vóxeles con un valor de uno. Para calcular los valores medios de las métricas de difusión en el hipocampo, haga clic en Herramientas y Calcular estadísticas de región de interés e indique las imágenes y la región de interés que se incluirán.
Después de hacer clic en Ejecutar, aparecerá una ventana emergente con los valores calculados que se pueden utilizar para un análisis estadístico adicional. En este experimento representativo, no hubo evidencia de fractura de cráneo evaluada por imágenes por TC y las imágenes T2 no mostraron ninguna anomalía en el sitio de la contusión un día después del trauma. Para examinar la calidad del paso de coregistro no rígido entre la imagen T2 y el conjunto de datos de difusión, se agregó una superposición de la imagen T2 al mapa de anisotropía fraccional codificado por color.
Los mapas paramétricos para la anisotropía fraccionaria, la difusividad media, la difusividad axial y los mapas paramétricos de difusividad radial podrían calcularse. Dentro de la región de interés, también se podría realizar el cálculo de los valores medios para los valores de kurtosis axial, media y radial, así como los valores de la fracción de agua axonal, la difusividad extra-axonal axial y radial, y la tortuosidad de la integridad del tracto de materia blanca. En este experimento representativo, el análisis de las métricas de imágenes del tensor de difusión reveló un aumento significativo en los valores de anisotropía fraccionaria y una disminución en los valores de difusividad después del impacto en el grupo de lesiones cerebrales traumáticas leves.
Las métricas de kurtosis de difusión también mostraron una disminución significativa de la kurtosis radial después del impacto, mientras que no se observaron cambios en la kurtosis axial o media. Usando el modelo de integridad del tracto de materia blanca, la difusividad extra-axonal radial mostró una disminución significativa y la tortuosidad demostró un aumento significativo en el grupo de lesiones cerebrales traumáticas leves un día después del impacto. Durante el análisis de imagen, es importante comprobar si el formato de datos de MRtrix se convirtió e importó correctamente en ExploreDTI y que cada paso de corrección se realizó correctamente.
En lugar del análisis basado en el ROI, se puede aplicar un análisis de voxel por voxel para investigar las alteraciones del cerebro entero. Esta técnica es muy valiosa dentro del campo de la neuroimagen y se puede aplicar a otros trastornos cerebrales, por ejemplo, la demencia y la esclerosis múltiple.
