Este protocolo proporciona un método claro para producir cortes transversales del hipocampo de alta calidad a partir de animales administrados con r-mTBI con el modelo ACHI. El modelo ACHI produce lesiones leves. No implica fracturas o hemorragias de cráneo, craneotomías o el uso de anestesia.
Además, permite registros electrofisiológicos estables. Estas técnicas permiten la investigación de los cambios en la plasticidad sináptica después de MTBI repetido, para los cuales la etiología es ampliamente desconocida, con el potencial de informar vías terapéuticas. Demostrando el procedimiento estarán Allyson Gross, estudiante de maestría para mi laboratorio, y el Dr. Eric Eyolfson, becario postdoctoral.
Comience colocando a la rata en un cono de sujeción, asegurándose de que el hocico y las fosas nasales estén cerca de la pequeña abertura de los conos para permitir una ventilación adecuada. Evite el movimiento de la rata manteniendo el cono cerrado en el extremo caudal con una pinza de plástico. Coloque manualmente el casco sobre la línea media de la rata restringida con el disco objetivo sobre el lóbulo parietal izquierdo.
A continuación, coloque la rata en la almohadilla de espuma antes de ajustar manualmente el impactador a la posición de extensión. Baje la punta del impactador manualmente para contactar el disco objetivo en el casco. Luego coloque el impactador en la posición de retracción para que el impactador se retire 10 milímetros por encima del casco.
Usando el dial del brazo estereotáxico, baje la punta del impacto 10 milímetros para volver a tocar el disco de orientación del casco. Luego, gire el interruptor de impacto para que la cabeza del animal se acelere rápidamente a seis metros por segundo durante 10 milímetros. Una vez activado el dispositivo, retire al animal del cono de sujeción inmediatamente para realizar un protocolo de evaluación neurológica inmediata, o NAP.
Después de sacrificar al ratón, disecciona el cerebro y colócalo en un papel de filtro humedecido en una placa de Petri al revés. Con un bisturí afilado, retire el cerebelo y la corteza prefrontal para secar el cerebro. Separe los dos hemisferios cortando la línea media del cerebro.
Para crear cortes transversales del hipocampo, coloque un hemisferio en la superficie medial, incline el bisturí a aproximadamente 30 grados hacia adentro y retire una rebanada delgada de la superficie dorsal del cerebro para proporcionar una superficie plana para el montaje en el pistón. Voltea el cerebro sobre la superficie dorsal y aplica suavemente el tejido cerebral sobre papel de filtro seco para eliminar el exceso de ACSF. Luego, conecte la superficie dorsal del cerebro al pistón con pegamento de cianoacrilato, dejando la superficie ventral en posición vertical.
Extienda el tubo exterior del pistón sobre el cerebro y vierta la agarosa líquida en el tubo hasta que el cerebro esté completamente cubierto. Solidifique rápidamente la agarosa sujetando un bloque de enfriamiento sobre el tubo del pistón. Coloque el pistón en la cámara de la cortadora y asegure la cámara con un tornillo.
Después de asegurar la cuchilla, agregue ACSF oxigenado helado a la cámara de corte. En la cortadora, ajuste la velocidad de corte a cuatro, la oscilación a seis y cambie el interruptor de corte único continuo a Continuo. Luego, presione Inicio para comenzar a seccionar el cerebro a 400 micrómetros.
A medida que la cortadora secciona el cerebro, use una pipeta Pasteur de gran diámetro para transferir cada rebanada al baño de recuperación de ACSF oxigenado. Deje que las rodajas se recuperen a 32 grados centígrados durante 30 minutos y luego déjelas recuperar durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Repita estos pasos para crear sectores del segundo hemisferio.
Utilizando un extractor de micropipetas disponible comercialmente, extraiga electrodos de registro de uno a dos megaohmios de capilares de vidrio de borosilicato de 10 centímetros con un diámetro exterior de 1,5 milímetros y un diámetro interior de 1,1 milímetros. Utilice una pipeta Pasteur y transfiera una rebanada del hipocampo desde el baño de recuperación a la cámara que se perfunde con ACSF carbogenado y se mantiene a 30 grados centígrados. Oriente el corte del cerebro para que el giro dentado y la capa de células granulares sean visibles en el campo de visión.
Use un microscopio vertical para visualizar el giro dentado con óptica oblicua. Coloque un electrodo estimulante bipolar concéntrico para activar la trayectoria perforante medial, o fibras MPP, en el tercio medio de la capa molecular. Luego, coloque una micropipeta de vidrio llena de ACSF en el MPP.
Comience con los electrodos más separados, ya que tocar el tejido dañará las fibras. Una vez que los electrodos de estimulación y grabación estén colocados, visualice las respuestas de campo evocadas utilizando un amplificador, un digitalizador y un software de grabación. Encuentre un potencial postsináptico excitatorio de campo adecuado, o EPSP de campo, estimulando el tejido con pulsos de corriente y asegurando una amplitud mínima de 0,7 milivoltios con una descarga de fibra transparente más pequeña que la EPSP de campo.
Aumentar y ajustar la intensidad de simulación hasta que el campo EPSP esté al 70% de la amplitud máxima. A continuación, establezca una línea de base de preacondicionamiento estable durante 20 minutos con pulsos de 0,12 milisegundos administrados a 0,067 hercios. Para un corte estable, la pendiente inicial del fEPSP debe ser inferior al 10% de variabilidad y la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de las pendientes EPSP del campo trazado debe ser inferior a 0,5.
Determinar los cambios en las propiedades sinápticas básicas utilizando estímulos de pulso pareado y construyendo curvas de entrada/salida de estímulo/respuesta. Para la prueba de pulso pareado, aplique una serie de pulsos pareados con un intervalo interpulso de 50 milisegundos a 0,033 hercios. Para las curvas de entrada/salida, aplique una serie de intensidades de estímulo crecientes de 0.0 a 0.24 milisegundos a 0.033 hertz para trazar el cambio de tamaño de la respuesta EPSP del campo.
Para estudiar la depresión a largo plazo que depende principalmente de la activación del receptor CB1, emplee 6, 000 pulsos a 10 hercios. Para las grabaciones posteriores al acondicionamiento, reanude durante 60 minutos adicionales utilizando estimulaciones de un solo pulso de 0,12 milisegundos a una frecuencia de 0,067 hercios. Después de la grabación posterior al acondicionamiento, administre los estímulos de pulso pareado seguidos de una curva de entrada / salida.
Compare estos con los registros basales con las alteraciones observadas en las propiedades de liberación presináptica y evalúe la salud del corte para registros a largo plazo. Durante el análisis, cumpla con los criterios de exclusión para determinar la retención de datos de segmentos individuales en el conjunto de datos de plasticidad presináptica. Excluya los sectores que muestran una pendiente grande en una línea de mejor ajuste de las pendientes EPSP de campo durante la línea de base de preacondicionamiento, inestabilidad en la línea de base de preacondicionamiento e inestabilidad en el período posterior a la condición.
Al inicio del estudio, el protocolo de evaluación neurológica, o puntuaciones NAP, no mostró diferencias entre las ratas mTBI simuladas y repetidas. Después de todas las sesiones de lesiones cerradas en la cabeza despiertas, las ratas mTBI repetidas mostraron deficiencias significativas dentro de las tareas de NAP en comparación con las simulaciones, lo que indica que se produjeron déficits de comportamiento sutiles pero significativos. Se administró una serie de pulsos pareados y se calculó la relación del tamaño del segundo campo EPSP en relación con el primer campo EPSP.
Las proporciones de pulso pareado no difirieron entre ratas mTBI simuladas y repetidas, revelando que las ratas mTBI repetidas no alteraron la fisiología sináptica básica en la entrada de MPP al giro dentado. Cuando se administró un protocolo de 10 hercios para inducir una depresión a largo plazo, hubo una disminución temporal pero significativa en la capacidad de la entrada de MPP al giro dentado para sostener la depresión a largo plazo el primer día posterior a la lesión. Sin embargo, para el día siete después de la lesión, las rebanadas de animales con mTBI simulados y repetidos mostraron una depresión equivalente a largo plazo, aunque hubo una indicación de una ligera tendencia a que los animales con mTBI repetidos exhibieran un aumento en la depresión a largo plazo.
Planificar el proceso de disección y corte por adelantado es fundamental para crear con éxito cortes viables del hipocampo y obtener registros electrofisiológicos estables. Este procedimiento crea una plataforma experimental estable que se puede utilizar para examinar la fisiopatología de la LCT y desarrollar nuevas vías terapéuticas. El movimiento desde la extracción del cerebro hasta su posicionamiento para cortar en la película comprimida para cortes transversales del hipocampo es importante, al igual que la colocación precisa de los electrodos en el giro dentado.
