Este método ayuda a superar las limitaciones en el estudio del desarrollo hematopoyético humano proporcionando una plataforma in vitro simple y manejable basada en la reprogramación directa de células. La demostración visual de este método proporcionará una guía ideal en pasos fundamentales para generar células hemogénicas humanas, a saber, durante la producción lentiviral, la transducción de fibroblastos y el cultivo celular. Al convertir fibroblastos de la piel en precursores hemogénicos, esperamos generar células hematopoyéticas específicas del paciente y células progenitoras en número suficiente para el trasplante de células madre.
Comience por el cultivo de células HEK293T en un plato tratado de cultivo de tejido de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM completo a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono hasta la confluencia. El día anterior a la transfección, después de aspirar el medio, lave el plato cuidadosamente con cinco mililitros de PBS y separe las células con 1,5 mililitros de solución de disociación. Después de incubar durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados, inactivar la solución con tres mililitros de DMEM completo y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.
Lave el plato con 5 mililitros de DMEM completo para eliminar las células conectadas restantes y tire del lavado con la solución celular. Recoger las células por centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet en seis mililitros de DMEM completo. Luego, divida la suspensión uniformemente entre seis platos tratados de cultivo de tejido de 100 milímetros en un volumen final de 10 mililitros de DMEM completo por plato.
Al día siguiente, añadir 10 microgramos de masa total de los tres plásmidos de transferencia juntos a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añada 10 microgramos de la segunda generación de vectores de empaquetado psPAX2 que codifican los genes gag, pol, tat y rev seguidos de la adición de cinco microgramos de pMD2. Vector de envolvente G que codifica el gen VSV-G al tubo.
Por último, agregue agua para llevar el volumen final a 500 microlitros. En dos nuevos tubos cónicos de 15 mililitros, agregue 10 microgramos de plásmido FUW-M2rtTA, 10 microgramos del vector de envasado y cinco microgramos del vector de envolvente a cada tubo. A continuación, agregue agua hasta un volumen final de 500 microlitros a cada tubo.
A continuación, añada 62,5 microlitros de dos cloruros de calcio molar a cada uno de los tres tubos y utilice un controlador de pipetas equipado con una pipeta Pasteur para liberar burbujas en cada mezcla. Mientras se forman las burbujas, añada 500 microlitros de solución salina tamponada BES contra la pipeta Pasteur y sobre la mezcla. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos hasta que las mezclas parezcan ligeramente turbias.
Durante la incubación, reemplace cuidadosamente el sobrenadante de los cultivos celulares HEK293T por 10 mililitros de DMEM completo sin antibióticos. Distribuya los complejos de ADN dropwise en platos individuales de cultivo celular HEK293T e incubar durante 24 horas. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por cuatro mililitros de DMEM completo por cultivo y devuelva los platos a una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados Centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente, recoger los sobrenadantes en un tubo de 50 mililitros por plato y añadir cuatro mililitros de medio fresco a cada plato. Después de ocho horas más de cultivo, acoja el sobrenadante en cada plato con el sobrenadante previamente cosechado y agregue cuatro mililitros de medio fresco. Devuelva los platos a la incubadora de cultivo celular durante la noche y recoja los sobrenadantes una última vez.
Cuando se haya recogido todo el virus, filtre cada sobrenadante lentiviral a través de un filtro de unión baja a proteínas de 0,45 micrómetros en tubos individuales y agregue un máximo de 15 mililitros de sobrenadante filtrado a unidades de filtro centrífugo individuales para la centrifugación. Deseche el flujo a través. Un líquido que contiene lentivirus viscoso permanecerá en la unidad de filtro.
Cuando todo el sobrenadante lentiviral se ha filtrado alícuota 50 a 200 microlitros de los lentivirus concentrados para almacenamiento en frío. Antes de comenzar el procedimiento de reprogramación, codifique una placa tratada de cultivo de tejido de seis pozos con 500 microlitros de 0,1% de gelatina por pozo e incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, aspirar la solución de gelatina restante.
Placa fibroblastos dérmicos humanos a una densidad de 1,5 veces diez a las quintas células por placa en dos mililitros de DMEM completo por pozo e incubar durante la noche. A la mañana siguiente, sustituya el medio de cada pozo por dos mililitros de DMEM completo suplementado con ocho microgramos por mililitro de polibrena y añada una mezcla de lentivirus de factor de transcripción producido en la piscina y M2rtTA en un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, transducir el fibroblasto con un volumen óptimo de la mezcla lentiviral, entre 10 y 100 microlitros por pozo.
Después de 16 horas de incubación, sustituya los sobrenadantes con DMEM completo y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante seis a ocho horas. Después de la recuperación, reemplazar los sobrenadantes con dos mililitros de DMEM completo suplementado con polibreno y realizar una segunda transducción como acaba de demostrar. Al final de la segunda incubación de transducción, sustituya los sobrenadantes con DMEM completo suplementado con un microgramo por mililitro de doxiciclina y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.
Al final de la incubación, dividir cada pozo en una proporción de uno a dos y replatear las células en dos mililitros por pozo de medio hematopoyético complementado con doxiciclina en una nueva gelatina recubierta de seis pozos. Para obtener un número suficiente de células para el análisis de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, placa tres veces 10 a la quinta fibroblastos en una gelatina recubierta de seis pozos de placa e incubar durante la noche. Al final de la incubación, transducir células dos veces en dos días consecutivos con 10 a 20 microlitros de lentivirus que contienen los factores individuales de interés o un conjunto de los tres factores más FUW-M2rtTA en una proporción de uno a uno.
16 horas después de la segunda transducción, eliminar el virus que contiene sobrenadante e incubar las células en DMEM completo durante 24 horas. Al final de la incubación, replaca el contenido de cada pozo en platos individuales recubiertos de gelatina de 100 milímetros tratados con DMEM completo con DMEM completo a un volumen final de 10 mililitros de medio por plato, y devolver las células a la incubadora de cultivo celular. Después de seis días, reemplace el sobrenadante con DMEM completo complementado con doxiciclina.
Devuelva los cultivos a la incubadora durante dos días adicionales. Como demuestran estas gráficas representativas de citometría, aproximadamente el 17% de las células reprogramadas expresan CD49f y CD9 después de 25 días de reprogramación. La mayoría de las células doblemente positivas expresan CD143 y una pequeña población expresa CD34, lo que sugiere una inducción dinámica del destino hemogénico.
Estos marcadores no se activan en fibroblastos dérmicos humanos transducidos por M2rtTA cultivados durante 25 días. Las imágenes de inmunofluorescencia confirman la expresión de CD9 y CD143 en células adherentes y redondas que son morfológicamente distintas de los fibroblastos, que son negativas para estos marcadores. Las imágenes de Brightfeild se realizan para visualizar la confluencia celular, la morfología y la formación de colonias a lo largo del proceso de reprogramación.
El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula de las células reprogramadas revela un aumento escalonado en la expresión CD49f, CD9 y CD143 de los días dos a 25. Después de la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, los perfiles del navegador genómico muestran la unión GATA2 a las regiones reguladoras genómicas de ITGA6 y ACE cuando los fibroblastos se cotrans inducen con los tres factores o GATA2 individualmente. El volumen de partículas antivirales añadidas al cultivo debe optimizarse para una reprogramación exitosa sin comprometer la viabilidad celular.
Esta plataforma se puede combinar con la inhibición farmacológica y las tecnologías de cribado a escala del genoma, como CRISPR-Cas9, para definir nuevos reguladores de la hematopoyesis definitiva humana. Este enfoque de reprogramación directa permitirá a los investigadores explorar nuevas preguntas en el campo de la hematopoyesis del desarrollo humano y descifrar los mecanismos subyacentes a la especificación de las células madre hematopoyéticas humanas. Es importante realizar recogidas y transducciones antivirales en una campana de flujo laminar dedicada al trabajo lentiviral y desechar los residuos contaminados virales en un recipiente adecuado.
