Staphylococcus aureus es una bacteria grampositiva que produce una amplia gama de factores de virulencia que promueven la patogénesis. Estas incluyen leucotoxinas bicomponentes que interrumpen la integridad de la membrana de los leucocitos polimorfonucleares, también llamados PMN o neutrófilos. Este video ilustra el aislamiento de PMN de sangre entera humana y dos ensayos distintos para cuantificar la citotoxicidad de S.aureus contra estas importantes células inmunitarias innatas.
Todos estos ensayos se pueden realizar con equipos de laboratorio estándar y son fácilmente adaptables para examinar otros aspectos de la interacción con patógenos del huésped. Estos experimentos utilizarán sangre entera extraída de donantes humanos y requerirán la aprobación del comité institucional o la junta de revisión correspondiente, así como una declaración de que se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. El primer paso de este procedimiento es el aislamiento de neutrófilos mediante el uso de centrifugación y gradientes de densidad.
En primer lugar, llevar 50 mililitros de 3%dextrano 0,9%cloruro de sodio, 35 mililitros de cloruro de sodio al 0,9%, 20 mililitros de cloruro de sodio al 1,8%, 12 mililitros de 1,077 gramos por mililitro de ficoll solución y 20 mililitros de agua a temperatura ambiente. Transfiera 25 mililitros de sangre humana entera heparinizada recién extraída a dos tubos cónicos de centrífugo. Combine 25 mililitros de sangre entera heparinizada recién extraída con 25 mililitros de volumen equivalente de temperatura ambiente, 3%dextrano, 0,9% cloruro de sodio en una proporción de uno a uno.
Mezclar balanceando suavemente cada tubo cónico de 50 mililitros y luego dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación a temperatura ambiente, aparecerán dos capas separadas. Transfiera la capa superior de cada mezcla de sangre dextrán a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros.
Centrifugar a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente con roturas bajas o sin descansos. Aspirar cuidadosamente tanto los sobrenadantes como desecharlos sin molestar los gránulos celulares. Resuspender suavemente cada pellet celular en dos mililitros de cloruro de sodio al 0,9%.
Combine los pellets resuspendidos en un solo 50 mililitros cónicos y luego agregue el 0,9% de cloruro de sodio restante a un volumen final de 35 mililitros. Subyuelo cuidadosamente 10 mililitros de 1.077 gramos por mililitro de solución de ficoll debajo de la suspensión celular usando una pipeta de mano. Después de girar a 450 g durante 30 minutos a temperatura ambiente, con roturas bajas o sin descansos, aspira suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet celular, como se ha demostrado anteriormente.
Lyse los glóbulos rojos resuspendiendo el pellet celular en 20 mililitros de agua a temperatura ambiente. Mezclar suavemente balanceando durante 30 segundos. Añadir inmediatamente 20 mililitros de cloruro sódico al 1,8% y de la muestra de centrífuga a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar cuidadosamente el sobrenadante como se muestra antes. Resuspender suavemente el pellet celular a dos mililitros de temperatura ambiente RPMI y colocar sobre hielo. Cuente las células usando un hemacytómetro.
Resuspender PMN purificados a una concentración de una vez 10 a las 7a células por mililitro con RPMI helada y mantener en hielo. Combine 100 microlitros de PMN purificados con 300 microlitros de DPBS, que contienen un microlitro de mancha de yoduro propidium en dos tubos de citometría de flujo de réplica. Para un control positivo, agregue 40 microlitros de 0.5%Triton X-100 solución en uno de los tubos de citometría de flujo y mezcle bien.
Utilice la citometría de flujo para medir la dispersión hacia adelante, la dispersión lateral y la tinción de yoduro propidium para determinar la pureza y la integridad de las PMN aisladas. Sólo se deben utilizar preparaciones de PMN que estén por encima del 98% puro y por encima del 95%propidium yoduro negativo. Para el protocolo que describe el aislamiento del suero humano normal, consulte el manuscrito completo.
Preparar una placa de 96 pozos para ensayos de citotoxicidad PMN añadiendo 100 microlitros de 20% aislados de suero humano diluidos con DPBS a pozos individuales que se utilizarán en este ensayo. Asegúrese de incluir al menos un pozo de control negativo que solo recibirá medios y al menos un pozo de control positivo que recibirá 0.05%Triton X.Incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, lave los pozos codificados dos veces con 100 microlitros de DPBS helado y coloque la placa sobre hielo.
Retire cualquier DPBS residual de los pozos de placas y agregue suavemente 100 microlitros de PMN humanos purificados a una vez 10 a las 7a células por mililitro a cada pozo codificado. Permita que los neutrófilos chapados se asienten dejándolos sobre hielo durante al menos cinco minutos antes de su uso en los siguientes ensayos de citotoxicidad. Esta sección describe un ensayo que cuantifica la citotoxicidad de las proteínas extracelulares producidas por estafilococo aureus contra PMNs humanos.
Culture S.aureus durante la noche en medios apropiados utilizando una incubadora de temblores establecida en 37 grados centígrados el día anterior al experimento. Subcultura S.aureus realizando una dilución de uno a 100 cultivos de bacterias durante la noche con medios frescos. Incubar a 37 grados centígrados con temblores hasta que las bacterias alcancen la fase de crecimiento estacionaria temprana.
Después de cinco horas de crecimiento, transfiera un mililitro de la subcultura S.aureus a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrífuga a 5.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspirar sobrenadantes. Pasar los sobrenadantes aspirados a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colocar en hielo.
Realizar diluciones en serie de sobrenadantes con medios fríos de hielo utilizados para cultivar Staph aureus. Agregue suavemente muestras sobrenadantes o medios prestados para controles negativos y positivos a pozos individuales de una placa de 96 pozos que contenga PMN en hielo, como se describió anteriormente. Placa de roca suave para distribuir sobrenadantes en pozos e incubar a 37 grados centígrados.
En los momentos deseados, retire la placa de la incubadora y colóquela sobre hielo. Agregue 300 microlitros de DPBS fríos que contengan un microlitro de yoduro de propidio a cada tubo de citometría de flujo. Transfiera las muestras a tubos de citometría de flujo sobre hielo.
Para el pozo de control positivo, agregue 20 microlitros de 10%Triton X a la muestra antes de transferir a un tubo de citometría de flujo. Analizar la tinción de yoduro de propidio de PMN intoxicadas utilizando citometría de flujo. Esta sección describe un ensayo que cuantifica la citotoxicidad de S.aureus después de la fagocitosis por parte de PMNs humanos.
Las curvas de crecimiento definidas por la densidad óptica a 600 nanómetros y la concentración de bacterias deben determinarse para las cepas Staph aureus relevantes antes de su uso en este ensayo. Comience cultivos nocturnos de cepas de S.aureus y bacterias de subcultura, como se describió anteriormente. Una vez que el subcultivo Staph aureus ha alcanzado un crecimiento exponencial medio, transfiera un mililitro de bacterias de cultivo a 1,5 mililitros de microcentrífuga y centrífuga a 5.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Lavar S.aureus aspirando su sobrenadante sin alterar el pellet y resuspender las bacterias peletadas en un mililitro DPBS. Vórtice las muestras durante 30 segundos. Centrifugar las muestras a 5.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Para oxenizar el estafilococo, primero resuspender el pellet bacteriano en un mililitro de 20% de suero humano. Luego incubar muestras a 37 grados Celsius con agitación durante 15 minutos. Lavar el estafilococo aureado en buey después de la centrifugación como se ha demostrado anteriormente.
Diluir las cepas de estafilococo diluido a una vez 10 a las unidades formadoras de colonias de 8a colonia, UFC por mililitro, con RPMI helada. Vórtice la muestra durante 30 segundos y colóquela sobre hielo. Confirme las concentraciones de Estafiloco aureus utilizadas para estos ensayos mediante el enchapado de una a 10 diluciones en serie de bacterias en el agar.
Agregue suavemente 100 microlitros por pozo de cada cepa Staph aureus, o RPMI para controles positivos y negativos, a pmNs en una placa de 96 pozos sobre hielo desde el paso 1.14. Placa de roca suave para distribuir Staph aureus en pozos. Sincronizar la fagocitosis mediante la centrifugación a 500 g durante ocho minutos a cuatro grados Celsius e incubar la placa a 37 grados Celsius inmediatamente después de la centrifugación como tiempo cero.
En los puntos de tiempo deseados, coloque la placa sobre hielo y agregue 200 microlitros de DPBS helado que contengan un microlitros propidium yoduro a cada tubo de citometría de flujo y luego transfiera las muestras a su tubo correspondiente. Analizar muestras para detectar la tinción de yoduro propidium utilizando citometría de flujo como se describe en 2.8 y 2.9. La transcripción de leucotoxinas bicomponentes dirigidas a PMNs humanas por Staph aureus requiere que el sistema de componentes SA o S2 demuestre la utilidad de los ensayos descritos para cuantificar la citotoxicidad stafilo aureo contra las PMN humanas.
Estos experimentos se realizaron con un aislado de Staph aureus clínicamente relevante identificado como USA300 en un mutante de eliminación isologénica de SA o S en esta cepa. El panel izquierdo representa las PMN purificadas y el panel derecho muestra las muestras contaminadas intencionalmente como un ejemplo. Las PMN aisladas mediante los procedimientos descritos en la sección uno de este protocolo se tiñeron con yoduro de propídico y se examinaron mediante citometría de flujo.
Las gráficas de dispersión hacia adelante y laterales se utilizaron para detectar la contaminación de pmN purificadas por monocitos o linfocitos durante los años 1A y 1B. Se determinó la integridad de PMN utilizando tinción de yoduro propidium. Mediante el uso del método descrito de purificación de PMN humana, podemos aislar constantemente cinco veces 10 a 7 a uno por 10 a la 8a PMN que son más de 98% puros y son más de 95%propidium yoduro negativo.
La citotoxicidad de las proteínas extracelulares producidas por USA300 y el mutante AsaeR/S se probaron contra PMN purificadas. Estos experimentos demuestran un aumento dependiente de la concentración en la tinción de yoduro propidium de PMN purificados después de 30 minutos de intoxicación con proteínas extracelulares producidas por USA300, pero no con el mutante AsaeR/S. Otros experimentos demostraron un aumento constante en la proporción de PMN positivas de yoduro propidium después de la intoxicación por las proteínas extracelulares USA300 que se estancaron después de aproximadamente 30 minutos.
La tinción mínima de yoduro de propidio de las PMN humanas se observó en todo momento después de la exposición a proteínas extracelulares producidas por el mutante AsaeR/S. Por último, se probó la citotoxicidad del mutante USA300 y AsaeR/S contra PMN después de la fagocitosis sincronizada, un aumento dependiente de la concentración en la proporción de PMN positivas de yoduro propidium se observó 90 minutos después de la fagocitosis de USA300. Significativamente menos PMN fueron propidium yoduro positivo después de la fagocitosis del mutante AsaeR/S.
La enumeración del inóculo mutante USA300 y AsaeR/S se utilizó en cada uno de estos experimentos demostró que el contraste en la citotoxicidad entre estas cepas no se debía a diferencias en la concentración de bacterias utilizadas. Este protocolo describe las purificaciones de PMN de la sangre humana en dos técnicas distintas para cuantificar la citotoxicidad de S.aureus contra estas células inmunitarias innatas. El éxito de estos procedimientos dependerá de la calidad de las PMN purificadas y de la preparación adecuada de bacterias o sobrenadantes Staph aureus.
Consulte el manuscrito completo para conocer los puntos importantes que debe tener en cuenta al realizar estos procedimientos. USA300 es un aislado de SARM virulento y la pérdida de AsaeR/S reduce drásticamente la transcripción de los factores de virulencia que se dirigen a los PMN humanos, haciendo de estas cepas modelos ideales para comparar la citotoxicidad utilizando los ensayos descritos. Adaptar las condiciones de crecimiento, volúmenes de sobrenadantes añadidos, o la relación de bacterias a PMN puede ser necesario cuando se utilizan otras cepas de Staph aureus.
