Los autores desean agradecer la contribución técnica de Gloria A Benavides. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), complicaciones diabéticas NIDDK Consorcio (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 subvención (VDU subcontrato), y la DK079337 P30 O&#39;Brien Centro de datos (PVD).

Todos los protocolos descritos en este manuscrito para la recogida de sangre, el aislamiento y el análisis han sido revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham. 1. Aislamiento de células (Modificado de Histopaque Sigma-Aldrich Protocolo N º 1119 y Miltenyi Biotec MICROBEAD positiva y protocolos de selección negativa) <ol><li> Centrifugar la sangre total (recogidas en ACD o tubos de EDTA) a 500 xg durante 15 min en una centrífuga con un rotor oscilante-cubo (aceleración = 5-6, y sin freno). </li><li> Retire la capa superior que contiene el plasma rico en plaquetas (PRP) con una pipeta de transferencia hasta el 1 cm se mantiene por encima de la capa de células (capa de eritrocitos / leucocitaria). Ponga a un lado el PRP a temperatura ambiente para su posterior procesamiento. </li><li> Transferir la capa leucocitaria a un tubo cónico de 50 ml estéril, se diluye hasta 24 ml con RPMI basal o a por lo menos 4 veces el volumen de partida capa leucocitaria. Nota: la mitad superior de la capa de glóbulos rojos puede hAVE a ser incluido, aunque esto se traducirá en aumentar el volumen de RPMI proporcionalmente. </li><li> Preparar el gradiente de densidad utilizando Ficoll de baja densidad con un peso específico de 1,077 (1,077) para la capa superior y de Ficoll de alta densidad con un peso específico de 1,119 (1,119) para la capa inferior en tres tubos cónicos de 15 ml (3 ml cada una). Para realizar este paso, primero añadir 1,077 a cada tubo. Usando una pipeta de 5 ml estrecha añadir 1119 a la parte inferior del tubo mediante la colocación de la punta de la pipeta por debajo de 1.077 y liberan lentamente el reactivo sin mezclarse con el gradiente superior. Un total de 6 ml de medios de gradiente de densidad debe estar presente en esta fase con una fase visible de separación en la marca de 3 ml. </li><li> Usando una pipeta automática, añadir 8 ml de sangre diluida (del paso 1.3) suavemente para cada tubo de gradiente utilizando el ajuste de baja potencia para evitar que perturben las capas de gradiente. El volumen total debe ser de 14 ml a este paso. </li><li> Tubos centrífuga a 700 g durante 30 min a temperatura ambiente (Acceleración 6, sin freno). Nota: En esta etapa, tres bandas distintas de células deben ser evidentes (Figura 1A). Las bandas superiores (entre 1077 y plasma) contiene células mononucleares (MNC) y plaquetas, y la banda media (entre 1007 y 1119) contiene células polimorfonucleares (PMN) y banda inferior (por debajo de 1119) contiene los glóbulos rojos. </li><li> Recoger el MNC y PMN separado mediante pipetas de vidrio estériles sin molestar a las otras bandas celulares. Combinar la población de MNC de cada tubo en un tubo cónico de 50 ml estéril. Repita esto para la población PMN también. </li><li> Añadir 4 volúmenes de medio RPMI a cada tubo que contiene las fracciones MNC y PMN respectivamente para diluir el gradiente de densidad. </li><li> Tubos de centrifugar a 700 xg durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento celular y MNC pellet de células PMN en 1 ml de RPMI que contiene 0,5% ultra puro libre de ácidos grasos BSA (RPMI-BSA) y transferir a tubos de 1,5 ml estéril. Sedimenten las células usando un picofuge sobremesa para 30seg. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender cada sedimento celular en 80 l de RPMI-BSA. </li><li> Añadir 20 l de perlas magnéticas anticuerpo marcado con antiCD14 al tubo que contiene la fracción MNC para la selección positiva de los monocitos. Para el tubo que contiene la fracción de células PMN, añadir 20 l de perlas magnéticas anticuerpo marcado con antiCD15 para la selección positiva de los neutrófilos. Incubar cada suspensión celular durante 15 min a 4 º C. </li><li> Lave cada suspensión de células con 1 ml de medio RPMI-BSA y pellets como antes y resuspender cada pellet en 500 l de RPMI-BSA. </li><li> Las células marcadas se separan en el campo magnético de la celda activada clasificación magnética (MACS) separador. Preparar las columnas MACS LS (uno para cada suspensión celular) mediante la colocación de la columna en el separador MACS y lavado con 3 ml de medio RPMI-BSA antes de la adición de la suspensión de células. </li><li> Después de aplicar suspensiones de células, lavar cada columna 3 veces con 3 ml de medio RPMI-BSA (asegúrese de dejar que el dre mediosn completamente entre lavados). Recoger la suspensión de células de flujo a través y lavados de columna en un tubo estéril. </li><li> Para aislar los monocitos y los neutrófilos, quitar la columna del campo magnético después del lavado final y la elución de las células seleccionadas positivamente en un tubo estéril con 5 ml de medio RPMI-BSA utilizando el émbolo de la columna. </li><li> Para aislar los linfocitos de pellets de la fracción de flujo a través de lavado de las multinacionales del paso 1,15 a 300 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 80 l RPMI-BSA. Añadir 20 l de anticuerpos CD61 y CD235a y se incuba la suspensión celular durante 15 min a 4 º C. Repita la separación MACS como antes y se recoge el flujo a pesar de que contiene los linfocitos. </li><li> Para sedimentar los monocitos, neutrófilos, linfocitos y fracciones, de centrífuga como antes (paso 1.9) y desechar los sobrenadantes. Los sedimentos celulares se deben resuspendieron en 1 ml extracelulares de flujo medio (XF-DMEM) para el recuento. &lt;br /&gt; Nota: 8 ml de sangre entera deben resultar en 1-5 x 10 6 monocitos / ml, y 5-20 x 10 6 linfocitos y neutrófilos / ml. </li><li> Para aislar las plaquetas, PRP centrífuga (paso 1.2) para 8-10 min a 1500 x g a temperatura ambiente. Retire el plasma y lavar sedimento celular una vez con estériles 5 ml de PBS suplementado con 1 mg / ml de PGI 2, repellet y suspender sedimento final en 1 ml de PBS-IGP tampón 2. </li><li> Determinar recuento de plaquetas por turbidimetría una vez que las plaquetas se suspenden en PBS-IGP tampón 2 por espectrofotómetro tal como se describe por Walkowiak et al uso de la siguiente ecuación: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x factor de dilución = # 10 x 8. plaquetas / ml 12. </li></ol> 2. Plating de las células <ol><li> Preparación de Cell-Tak (adhesivo celular): Añadir adhesiva celular 90 l 180 l diH 2 0, 540 l de 0,1 N bi sodiocarbonato (pH 8,0), y ajustar el pH a 7.2 a 7.8 con 1 N de NaOH. Preparar placas XF (de 24 pocillos, V7 microplacas) mediante el recubrimiento de cada pocillo con 30 l de adhesivo de células preparada. Nota: El adhesivo celular debe prepararse fresca para cada uso. </li><li> Incubar la placa a 37 º C durante 20-30 min a continuación, adhesivo de células Aspirar y lavar los pocillos dos veces con PBS (1 ml / pocillo). </li><li> Realizar un recuento de células en monocitos aislados, linfocitos, neutrófilos y plaquetas y llevar a volumen apropiado utilizando XF-DMEM para permitir una densidad de siembra de 250k células / pocillo para los monocitos, linfocitos y neutrófilos, y 25 x 10 6 / pocillo para las plaquetas. Alternativamente, para medir la respuesta de estallido oxidativo, los neutrófilos pueden ser sembradas a 125 K células / pocillo. El volumen de la siembra final para cada suspensión celular debe ser de 200 l / pocillo. </li><li> Centrifugar la placa a 200 xg durante 1 seg sin freno. Gire la placa de 180 ˚ y centrifugar de nuevo sin freno a 300 x g. </li><li> Traiga vol pocillo finalUME a 660 l con XF-DMEM y se incuba a 37 º C durante 30 min antes del ensayo XF. Nota: Las fotomicrografías de células cultivadas en placas antes y después del ensayo se puede usar para asegurar chapado adecuado y descartar desprendimiento celular. </li></ol> 3. Preparación de un 24-así placa extracelular Ensayo de flujo (XF24) <ol><li> Hidrato XF sondas con solución de calibrado para un mínimo de 2 horas antes del ensayo. </li><li> Preparar 10x existencias de 0,5 mg / ml, 0,6 M oligomicina FCCP, y 10 mM antimicina A en XF-DMEM y la carga de 75 l de soluciones madre en los puertos de inyección del cartucho en el orden anterior. Si las mediciones de ráfagas oxidativas se han de obtener, la inyección de 10x de 100 ng ml de PMA / puede inyectarse después antimicina-A. </li><li> Calibrar el cartucho hidratado y cargada y realizar el ensayo XF. Los métodos detallados para el análisis y la interpretación de tanto el consumo de oxígeno y pH cambios se han descrito en publicaciones previas 9,13,14 y no se discussed en detalle aquí. </li><li> Después de ensayo XF, aspirar todo, pero los últimos 50 l de XF-DMEM después de ensayo para prevenir la pérdida de células de la placa y añadir 50 l de tampón de lisis RIPA de células y realizar un ensayo de proteínas para la normalización. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU es miembro del Consejo Asesor Científico Bioscience Seahorse.

Este protocolo representa la compilación de varias técnicas comúnmente utilizadas para el aislamiento de células de la sangre en una forma adecuada para el análisis de la bioenergética. Las técnicas contiguos presentados son ventajosas para otros métodos de aislamiento (es decir, análisis de FACS) para su capacidad de aislar grandes números de células en las condiciones de los medios de comunicación controlados con tensiones mínimas colocados en las células aisladas. Tiene la desventaja de largos aislamientos incluso con interrupciones mínimas. Este protocolo sirve como la base para el aislamiento de células de la sangre primarios a partir de sujetos humanos, que pueden ser extrapoladas en entornos clínicos y de investigación traslacional. MACS separación es una técnica fiable de aislamiento de células que ofrece la posibilidad de aislar las células directamente de la sangre entera, sin embargo, este método requiere mayores cantidades de anticuerpo y no es óptimo para el aislamiento de todos los cuatro tipos de células distintas que se describen en este método. Tiene ybeen hay evidencia para demostrar que la selección positiva de los leucocitos por resultados de separación MACS en la activación utilizando nuestro protocolo de aislamiento. Columnas MACS funcionan mediante el secuestro de células marcadas en un campo magnético utilizando anticuerpos conjugados con 50 partículas superparamagnéticas nm. Las células marcadas se eluyen de la columna. Selecciones positivos y negativos se implementan en este protocolo para garantizar el aislamiento rápido y pureza. Si el número de células inadecuadas se obtienen de aislamiento o pureza está en cuestión, más anticuerpos pueden ser añadidos a la muestra según la instrucción del proveedor y segundo paso a través de la columna de la LS puede resultar en una mayor pureza (Tabla 2). Nuestro laboratorio encontró alta pureza y eficiencia en placas utilizando el protocolo existente mediante el análisis de las suspensiones celulares finales por análisis FACS 8. Analizadores de flujo extracelulares tienen la capacidad de controlar tanto el consumo de oxígeno y la acidificación de los medios de comunicación en tiempo real sobre la de OTsus electrodos. El consumo de oxígeno como se observa por la respuesta de estallido oxidativo en neutrófilos y monocitos es dependiente de la NADPH oxidasa como se muestra por la inhibición con el DIP 8. Hemos visto una pérdida de tiempo depende de la capacidad de ruptura oxidativa con aislamientos prolongados o ensayos XF extendidas. Este protocolo fue diseñado y desarrollado para su uso en la XF24 pero también es compatible con el XF96 en aproximadamente un tercio a la mitad de la célula XF24 siembra de densidades (Figura 3). En el diseño de este protocolo, se requiere la adhesión a los protocolos existentes para cada técnica para un rendimiento óptimo con las modificaciones realizadas exclusivamente para el control de las condiciones de los medios de comunicación para el análisis bioenergético. Después de dominar técnicas, un protocolo de este tipo se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones de la traducción y de investigación para medir la toxicidad o eficacia de las estrategias de tratamiento, explorar características metabólicas de la enfermedad, y la producción de oxidantes por los monocitos y Neutrophils en condiciones inflamatorias.

Control de la salud bioenergético de las células inmunes (monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas) a partir de sangre ha sido reconocida durante algún tiempo como una herramienta de diagnóstico potencialmente útil para evaluar la salud bioenergético general de un individuo. Hay un cuerpo emergente de la literatura atribuir un número de enfermedades tales como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas a 1,2 disfunción mitocondrial. Esto es clínicamente importante, ya que la disfunción mitocondrial puede iniciar una serie de eventos celulares que promueven vías de señalización pro-inflamatorias o conducen a la muerte celular. Varios estudios han caracterizado la función mitocondrial de las células mononucleares de sangre periférica y plaquetas en condiciones tales como la fibromialgia, la diabetes, el choque séptico, y la enfermedad de Alzheimer 3-7. Por ejemplo, un estudio reciente evaluó la bioenergética de plaquetas como un marcador para la función mitocondrial y se encontró que las plaquetas de Tipo 2 Diabetpacientes con CI habían disminuido mitocondrial 7,8 consumo de oxígeno. A partir de estos hallazgos y otros, está claro que los monocitos, linfocitos, neutrófilos, y las plaquetas pueden servir como marcadores sustitutos de los cambios en la bioenergética bajo condiciones patológicas ya que encuesta de la circulación sistémica y pueden reflejar cambios metabólicos locales y globales. Para determinar si este enfoque tiene un método de alto rendimiento de análisis y se requiere un método consistente para la preparación de células valor pronóstico o de diagnóstico. Los métodos para medir la función mitocondrial en los leucocitos y las plaquetas previamente han implicado el aislamiento de las mitocondrias o la evaluación de la bioenergética celular en células intactas 4,9. La ventaja de la evaluación bioenergética celular utilizando un flujo extracelular (XF) analizador es que la función mitocondrial en las células se puede establecer con sustratos endógenos y los parámetros respiratorios tales como fugas de protones y respiratorio máximocapacidad se puede determinar. Nosotros y otros han utilizado esta tecnología para mostrar que los perfiles de bioenergéticos en plaquetas, monocitos y linfocitos aislados de sangre humana se pueden establecer y compararon entre los tipos de células 8. Además, neutrófilos y monocitos poseen una capacidad de explosión oxidativa en el que se activan oxidasas NADPH y consumen el oxígeno para formar superóxido. Es importante destacar que esta vía es un componente clave de la inmunidad innata y es modulada por la inflamación sistémica. Por ejemplo, se ha demostrado que los cambios en la capacidad de estallido oxidativo se asocian con varias enfermedades autoinmunes tales como la esclerosis múltiple, artritis, infecciones recurrentes y 10,11. De momento no hay alto rendimiento ensayos cuantitativos disponibles para medir el estallido oxidativo en muestras clínicas. Esto es importante ya que la caracterización de la capacidad de explosión oxidativa de los neutrófilos y los monocitos también puede servir como una herramienta de diagnóstico importante por varias patologíasgías. Los principales desafíos técnicos han sido baja sensibilidad para la medición del consumo de oxígeno usando técnicas convencionales polarográficos y la necesidad de utilizar células unidas cuando se utilizan técnicas fluorométricos microplaca más sensibles. En este vídeo práctica, se describe la solución técnica a estos problemas. Detallamos los métodos para el aislamiento, la galvanoplastia y la medición de la bioenergética de monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas y la explosión oxidativa de los monocitos y los neutrófilos de la sangre humana. Este método es adecuado para la evaluación clínica de la bioenergética y el estallido oxidativo de los investigadores que tienen el acceso a una población de pacientes y la capacidad de obtener muestras de sangre fresca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

La disfunción mitocondrial se sabe que juega un papel importante en un número de condiciones patológicas tales como la aterosclerosis, la diabetes, el choque séptico, y enfermedades neurodegenerativas, pero la evaluación de cambios en la función bioenergética en pacientes es un reto. Aunque las enfermedades tales como la diabetes o aterosclerosis clínicamente presente con insuficiencia órgano específico, los componentes sistémicos de la patología, tales como la hiperglucemia o la inflamación, pueden alterar la función bioenergética en los leucocitos o plaquetas circulantes. Este concepto ha sido reconocido desde hace algún tiempo, pero su aplicación generalizada se ha visto limitada por el gran número de células primarios necesarios para el análisis bioenergético. Esta limitación técnica ha sido superado mediante la combinación de la especificidad de las técnicas de aislamiento de perla magnética, técnicas de adhesión celular, que permiten a las células a ser unidos sin activación para microplacas, y la sensibilidad de las nuevas tecnologías diseñado para micrófono de alto rendimientorespirometría roplate. Un ejemplo de este equipo es el analizador de flujo extracelular. Tal instrumentación normalmente utiliza oxígeno y pH sondas sensibles para medir las tasas de cambio en estos parámetros en células adherentes, que pueden estar relacionados con el metabolismo. Aquí se detallan los métodos para el aislamiento y el chapado de monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas, y sin activación, a partir de sangre humana y el análisis de la función bioenergética mitocondrial en estas células. Además, demostramos cómo la explosión oxidativa en los monocitos y los neutrófilos también se puede medir en las mismas muestras. Dado que estos métodos utilizan sólo 8-20 ml de sangre humana que tienen un potencial para el control de generación de especies reactivas de oxígeno y la bioenergética en un entorno clínico.

Con el fin de evaluar la bioenergética de células de la sangre, la sangre total se obtiene de sujetos humanos por punción venosa en un tubo de recogida de vacutainer con EDTA o ACD. El aislamiento de leucocitos y plaquetas después de la recogida de sangre se visualiza en la Figura 1A como se detalla en el protocolo. Las muestras de sangre se procesan dentro de las 8 horas de la recolección para evitar la muerte celular y la activación. Los tiempos de almacenamiento ampliada de más de 8 horas no han sido evaluados, pero pueden dar lugar a la bioenergética alteradas y ser menos representativa de las condiciones fisiológicas. Tubos de dextrosa citrato ácido (ACD-8 ml) y vacutainer con EDTA se han utilizado para aislamientos de células sin efecto observado en la función bioenergética de células aisladas. Los anticoagulantes son necesarios ya que los coágulos de reducir el número de células obtenidas, interfieren con la formación de fases apropiada durante la centrifugación en gradiente de Ficoll, y dan como resultado poco o nada de plaquetas obtenidos en el suero se centrifugó. Toda la sangre representa un biologpeligro ical y equipo de protección personal deben ser implementadas a lo largo de todo el procedimiento, incluso después de las poblaciones de células se aíslan o lisados ​​celulares se generan. Las muestras deben ser eliminados de acuerdo con las normas de eliminación de residuos humanos de la institución. La sangre total se centrifuga para separar el plasma rico en plaquetas a partir de la capa leucocitaria, la capa blanca justo por encima de los glóbulos rojos empaquetados que contiene los leucocitos. La capa leucocitaria se aplica a los gradientes de densidad y se centrifugó para obtener las células mononucleares de sangre periférica (monocitos y linfocitos) y células polimorfonucleares (granulocitos). Contaminación de la FC de las fases celulares individuales MNC y PMN es común en esta etapa y debe ser resuelto durante la purificación MACS. Los diversos tipos de células se obtienen entonces por incubación con anticuerpos magnéticas para obtener fracciones puras. Los monocitos se recogen por incubación de la fracción de PBMC con CD14, el flujo a través de Tmonocitos que contienen linfocitos, que a continuación se agotan de glóbulos rojos y plaquetas. Los neutrófilos se obtienen mediante la incubación de la capa de células polimorfonucleares con el anticuerpo CD15 (Figura 1A). A partir de entonces, las plaquetas pueden ser sedimentaron por centrifugación del plasma rico en plaquetas y se lavan para eliminar otros componentes del plasma. Después de estas selecciones las plaquetas, monocitos CD14 +, linfocitos, neutrófilos CD15 + se pueden contar y se sembraron en una placa analizador de adhesión celular recubierto de mediano XF para la bioenergética y el análisis de la explosión oxidativa. Cada etapa del procedimiento debe realizarse en condiciones estériles y se anima a evitar la activación prematura de la respuesta de estallido oxidativo en monocitos y neutrófilos. Un indicador de menos de condiciones estériles durante el aislamiento es evidente cuando los neutrófilos, que tienen poco o ningún consumo de oxígeno en condiciones basales, comienzan el ensayo de flujo extracelular con mediciones elevadas de OCR queaumentar o disminuir a lo largo del ensayo de forma gradual. Hacemos hincapié en la importancia de imágenes de células mediante microscopía de luz a 200X o más para asegurarse de que no hay signos morfológicos de activación se han producido antes del ensayo. Por ejemplo, los neutrófilos normalmente muestran una redondeada a la forma irregular con límites de las celdas marcadas como se ve en la Figura 1B. Sin embargo, estas células se aplanan contra la superficie de la placa cuando se activa y perder su morfología celular distinta. Hemos informado anteriormente de que los cambios morfológicos de los leucocitos y las plaquetas activadas mediante este protocolo y se deben tomar medidas adicionales para garantizar condiciones estériles si encuentro activación 8. Un esquema simplificado del protocolo se ve en la Figura 2 como una tabla de tiempo en el que los pasos principales de la aislamiento de células, XF placa preparación, y ensayo de XF son detallada. El aislamiento consiste en la separación por gradiente de densidad de tipos de células yes seguido por separación magnética. Paralelo al proceso de aislamiento de células, XF placa preparación es necesaria para evitar retrasos en la celda o de chapado de comenzar el ensayo XF. Esto es fundamental, ya que los retrasos significativos pueden conducir a la activación celular y los parámetros bioenergéticos disminuidos. Concentraciones de células inadecuada después de aislamiento son un problema y la optimización de cada proceso de centrifugación común es necesario para evitar la pérdida de células. Aislamientos exitosos se han realizado en tan sólo 6 ml de sangre pero las alteraciones se pueden hacer en función de las concentraciones del tipo celular deseado en circulación. Si el gradiente de densidad se prepara de forma inadecuada, fases de células diferenciadas podrían no ser visibles y pueden ocurrir pérdida de células (ver JoVE video instructivo para una demostración visual). Plaquetas insuficiente aislado del PRP es rara, pero se ha producido si el buffer de lavado no contiene PGI 2 o si el aislamiento se lleva a cabo por debajo de la temperatura ambiente. El riesgo de una plaquetasctivation se evita a menudo si las plaquetas son las últimas células que se van aislados, sin embargo, si las plaquetas permanecen en tampón de lavado durante períodos prolongados se verán afectados la bioenergética. Se han dado casos de las poblaciones más pequeñas de plaquetas que no pellet durante la centrifugación 1.500 xg y la bioenergética de estas células no se ha caracterizado ampliamente. Consulte la Tabla 2 para una guía más completa sobre la solución de problemas. Los perfiles bioenergéticas de los leucocitos y las plaquetas se pueden determinar usando el analizador XF, que mide en tiempo real consumo de O 2 en las células de forma no invasiva. Cada tipo de célula se cultiva en placa sobre la placa de XF24 con cinco repeticiones como se muestra en la Figura 3A. Tabla 1 indica la valores basales y el estallido oxidativo esperados por tipo de células durante el ensayo y las concentraciones medias de proteína por pozo. Tecnologías de mayor rendimiento están disponibles, tales como el XF96, que permitecuatro donantes a ser evaluadas simultáneamente como se muestra en la Figura 3B. Después del ensayo, los datos se exportan a un ordenador puesto de trabajo para el análisis utilizando el software XF adecuada y Microsoft Excel. Los valores de OCR se normalizaron con el contenido total de proteínas en los pocillos correspondientes y se expresaron como pmol / min / mg de proteína. Los perfiles de ráfaga-bioenergéticos oxidativo representativas de cada tipo de célula se informó recientemente por nuestro grupo de 8. Un análisis más detallado de los parámetros bioenergéticos del ensayo (basal, el ATP-ligado, de fugas de protones, máxima, no mitocondriales y estallido oxidativo) puede calcularse para pozos individuales como se indica anteriormente y se describe a continuación 8. La tasa de consumo de oxígeno basal (OCR) es establecida por los primeros 3 mediciones como se muestra en la Figura 4A. Oligomicina (0,5 g / ml), un inhibidor de la ATP mitocondrial-sintasa se inyecta en el medio XF para estimar el OCR acoplado a la síntesis de ATP y representación<html> Ted como vinculados-ATP. El OCR residual menos el OCR no mitocondriales pueden ser atribuidos a la fuga de protones. Entonces se añade un desacoplador FCCP para determinar la máxima de OCR, seguido de antimicina-A, un inhibidor de la respiración mitocondrial, para determinar las fuentes no mitocondriales de consumo de oxígeno. La capacidad de reserva es una medida de la cantidad de ATP que se puede producir bajo demanda energética y se puede calcular como la diferencia entre el porcentaje máximo de la respiración y la basal. Con el fin de determinar la capacidad de ruptura oxidativa, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) un agonista de la PKC se inyecta para aumentar la actividad de la NADPH oxidasa, y el aumento en la tasa de consumo de oxígeno tras la estimulación con PMA se puede medir usando el analizador XF. Figura 4B mostrar la forma de calcular los distintos parámetros de la función mitocondrial y el estallido oxidativo. <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Aislamiento de leucocitos y plaquetas de sangre entera. A) los especímenes recién recogida se separan en su plasma y componentes celulares por centrifugación y se purificaron mediante gradiente de densidad Ficoll y magnética clasificación de células activadas (MACS) por positivo (monocitos y neutrófilos) o selección negativa (linfocitos), mientras que las plaquetas están aislados por una alta velocidad de la centrifugación del plasma rico en plaquetas. B) Las imágenes de las poblaciones de células aisladas vez resuspendidas en DMEM XF y chapadas en densidades celulares indicadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Preparación de las placas XF24 para estudios bioenergético de leucocitos y plaquetas. Línea de tiempo detallada para la preparación de una placa de ensayo XF24 por aislamiento de células y de las planchas y la hidratación del cartucho y el puerto de inyección de carga. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> Figura 3. Disposición de los leucocitos y las plaquetas en XF24 y XF96 placas analizador. A) Los leucocitos (células 125-250k / pocillo) y las plaquetas (25 x 10 6 células / pocillo) de un solo donante se colocan en la placa de ensayo XF24 entre fondo controles. 75 l de 10x existencias de oligomicina (0,5 g / ml), FCCP (0,6 M), antimicina A (10 mM), y la PMA (100 ng / ml) diluido en medios XF se cargan ena los puertos de inyección indicadas. B) Los leucocitos (células 75-150k / pocillo) y las plaquetas (10 x10 6 células / pocillo) de un máximo de cuatro donantes puede ser plateado en el XF96 en un volumen total de 180 l XF-DMEM. 20 l de 10x existencias de oligomicina (1,0 g / ml), FCCP (0,6 M), antimicina A (10 mM), y PMA (100 ng / ml) diluido en XF-DMEM que se cargan en los puertos de inyección indicados. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> Figura 4. Análisis de los índices bioenergéticos. A) traza Representante de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) por las mitocondrias y el estallido oxidativo en los monocitos. Basal OCR se estableció (primeros 3 tipos según lo señalado por los números en círculos). Entonces adiciones secuenciales de oligomicina (o; 0,5 g / ml), FCCP (F; 0,6 M) y antimycin-A (A; 10 mM) se inyectan para determinar la mitocondria y la respiración no mitocondriales de las células no activadas. Finalmente, PMA (100 ng / ml) se añade para medir el estallido oxidativo. B) análisis modular de la función mitocondrial y explosión oxidativa se calculan por las diferencias en las tasas como se indica. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;"> Densidad de siembra óptima </td><td style="width:215px;"> Promedio. Basal OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Promedio. Estallido oxidativo OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Promedio. proteína (g) / pocillo </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Los monocitos </td><td> 250k células / pocillo </td><td> 83,9 (± 13,0) </td><td> 300,3 (± 58,8) </td><td> 19,0 (± 2,4) </td></tr><tr height="40"><td height="40"style = &quot;altura: 40px;&quot;&gt; Los neutrófilos </td><td> 250k células / pocillo </td><td> 6,1 (± 2,2) </td><td> 1411,8 (± 233.3) </td><td> 20,6 (± 2,7) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Los linfocitos </td><td> 250k células / pocillo </td><td> 52,9 (± 7,7) </td><td> 15 (± 4,1) </td><td> 13,2 (± 2,1) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Las plaquetas </td><td> 25 x 10 6 células / pocillo </td><td> 199,4 (± 20,3) </td><td> 24 (± 2,7) </td><td> 47,5 (± 3,1) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Parámetros normales para el ensayo XF24: El promedio basal (Tarifa 3), y el estallido oxidativo (Tarifa 7) OCR no corrige a OCR no mitocondriales o proteína se muestran según el tipo de células en placas a las densidades celulares indicadas. El contenido medio de proteína por pozo se muestra como se realizó mediante un ensayo DC Lowry. Estos datos representan los valores medios de6-8 donantes sanos con paréntesis que contiene ± SEM. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td> Paso </td><td> Problema </td><td> Posible razón </td><td> Solución </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;"> plasma claro </td><td style="width:199px;"> plaquetas sedimentadas durante la centrifugación </td><td style="width:199px;"> disminuir el tiempo de centrifugación de 10 min o lenta a 400 xg </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> plasma lechosa </td><td style="width:199px;"> el exceso de lípidos </td><td style="width:199px;"> evitar la recolección postprandial </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;"> bandas celulares incompletas formadas </td><td style="width:199px;"> diablillopreparación gradiente cordelero, reactivo frío </td><td style="width:199px;"> evitar la interrupción de gradiente durante el pipeteado, reactivo de temperatura y utilizarlo habitación </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> grupos en bandas celulares </td><td style="width:199px;"> coagulación de la sangre puede haber ocurrido </td><td style="width:199px;"> Recoger la sangre usando anticoagulantes como ACD o EDTA </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;"> No sedimento celular </td><td style="width:199px;"> véase el paso 1.6 </td><td style="width:199px;"> Si nebuloso sobrenadante ver más abajo </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> sobrenadante turbio </td><td style="width:199px;"> Contaminación gradiente de Ficoll pesado, contaminación por plaquetas </td><td style="width:199px;"> Aumentar la velocidad de la centrifugación a 900 xg, dilaúd con más RPMI </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16, 1.17 </td><td style="width:199px;"> bajo rendimiento de los leucocitos </td><td style="width:199px;"> contaminación grave RBC, no llega suficiente sangre entera, la coagulación </td><td style="width:199px;"> Volúmenes de anticuerpos doble y RPMI-BSA, recoger más sangre, añadir anticoagulante </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.19 </td><td style="width:199px;"> la agregación plaquetaria </td><td style="width:199px;"> PGI 2 se omite, la exposición a los medios de comunicación en frío, el almacenamiento prolongado en el plasma </td><td style="width:199px;"> añadir PGI 2 de tampón de lavado de plaquetas, reactivos de temperatura uso de la sala </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.20 </td><td style="width:199px;"> bajo recuento de plaquetas </td><td style="width:199px;"> pérdida durante la centrifugación primaria, la agregación plaquetaria </td><td style="width:199px;"> Verpasos 1.2 y 1.19 </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> Contaminación de la FC </td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> Repita separación MACS </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Leucocitos y plaquetas aislamiento solución de problemas. La tabla muestra los problemas comunes encontrados durante leucocitos y plaquetas aislamiento de células de la sangre y soluciones que pueden orientar a los usuarios a través del proceso de resolución de problemas en general.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células.

Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K vistas.  University of Alabama at Birmingham.  Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células. 

Video: Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...