Nuestro protocolo observa que el uso de extractos renales de vacas y cerdos son un recurso excelente y económico para el estudio de la fisiología renal, particularmente examinando la correlación entre el factor de crecimiento endotelial vascular y otros analitos. Siempre ha sido un reto correlacionar el VEGF, un factor de crecimiento esencial en la angiogénesis orgánica, con otras proteínas. Esta técnica nos permite examinar la asociación entre VEGF y analitos como las hormonas.
Esto sin duda avanzará nuestra base de conocimiento con respecto a este importante factor de crecimiento. Este método puede ser útil para correlacionar otros analitos en extractos corticales renales además de los mencionados en este video. La demostración visual ayudará a otros a obtener resultados reproducibles sin errores de muestreo.
El uso de tejido fresco es esencial para el éxito de esta técnica. Es importante obtener riñones enteros frescos inmediatamente después del sacrificio de un animal. Transfiera siempre el tejido al laboratorio sobre hielo.
Use tijeras estériles, fórceps, un cuchillo y platos Petri para diseccionar los riñones e extirpar la porción de tejido requerida. Corte suavemente el riñón por la mitad a lo largo del plano sagital y corte un pedazo de tejido de la región de la corteza en el centro del riñón. Picar el tejido en trozos pequeños con el cuchillo y transferirlo a un tubo de microfugo con un mililitro de hielo frío 1X RIPA tampón de extracción de lisis.
Etiquete el tubo con detalles específicos de la muestra y colóquelo sobre hielo. Utilice un homogeneizador de mano con una sonda estéril para homogeneizar el tejido durante uno o dos minutos hasta que no se alcancen trozos visibles, luego centrifugar inmediatamente el tubo a 9.600 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, prepare alícuotas separadas de la muestra para ELISA y análisis total de proteínas para evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación.
Antes de iniciar el ensayo, lleve todos los reactivos y la placa de ensayo a temperatura ambiente eliminando el exceso de pozos y almacenándolos a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior. Diluir el tampón de lavado 20X a 300 mililitros con agua doble destilada y configurar los pozos en blanco sin ninguna solución. Añadir 50 microlitros de estándar o muestra y otros 50 microlitros de conjugado de peroxidasa de rábano picante a cada pozo, luego añadir inmediatamente 50 microlitros de solución de anticuerpos a cada pozo y sellar la placa.
Mezcle el plato e incubarlo a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, lavar cada pocótete con 200 microlitros de tampón de lavado. Añadir 50 microlitros de sustrato A y sustrato B a cada pozo, mezclar la placa suavemente tocando en el lado, luego sellar y incubar en la oscuridad durante 15 minutos a 37 grados Celsius.
Agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pozo. Toque suavemente la placa y lea la absorbancia a 450 nanómetros con un espectrofotómetro. Prepare los reactivos y el tampón de lavado como se describió anteriormente, luego agregue 100 microlitros de estándar o muestra a cada pozo, selle la placa, mezcle bien e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados.
Retire el líquido de cada pozo y agregue 100 microlitros del reactivo de detección A.Selle la placa e incubarla durante otra hora. A continuación, lave cada pozo con 400 microlitros de tampón de lavado, luego agregue 90 microlitros de solución de sustrato a cada pozo, toque suavemente la placa e incubar durante otra hora a 37 grados centígrados. Después de la última incubación, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pozo, toque suavemente la placa y lea la absorbancia a 450 nanómetros con un espectrofotómetro.
Estimar la proteína total de los extractos renales bovinos y porcinos con un ensayo estándar de BSA y utilizar esta estimación para normalizar los resultados de LH y VEGF-A-ELISA. Los niveles medios y medios de LH y VEGF se calcularon tanto para animales como para sexos. Después de verificar la normalidad de los datos, se utilizaron modelos de regresión lineal para examinar la relación entre LH y VEGF.
Se encontró que la LH era un predictor fuerte y significativo de VEGF en los riñones bovinos y porcinos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar muestras de áreas idénticas en cada tejido. Un procedimiento similar se puede utilizar para extraer cualquier tipo de tejido.
Recuerda normalizar los analitos mediante un extracto de proteína total de cualquier tejido que uses.
