Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Preparación de Instrumentos y Working Solutions <ol><li> Preparar la solución de agua los peces. Hacer una solución madre disolviendo 2 g de sales marinas &#39;Instantánea Océano&#39; en 50 ml de agua destilada. Añadir 1,5 ml de existencias de peces de agua a 1 l de agua destilada para preparar listo para utilizar peces de agua (sales marinas 60 microgramos / ml concentración final). Autoclave listo para el uso del agua de pescado antes de su uso. Esta solución se utiliza como medio de embrión de pez cebra. </li><li> Preparar metilcelulosa para montaje embrión. Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 50 ml de agua estéril peces. Facilitar la disolución mediante el uso de un imán en una placa de agitación. La disolución completa del polvo puede requerir varias horas. Revise la solución para la claridad y la alícuota en pequeños tubos. Almacenar a -20 ° C durante meses y descongelar alícuotas a su uso. Centrifugar la metilcelulosa a 950 xg durante 5 min antes de usar. Evite los ciclos de congelación y descongelación de alícuotas. </li><li> Preparar 50 ml de tricaína / acetato de 3-aminobenzoato msal de etanosulfonato (solución madre) por disolución de 200 mg de tricaína en 100 ml de agua y ajustar el pH a 7,0 usando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde esta población a 4 º C durante no más de 30 días. PRECAUCIÓN: tricaína es tóxico. Use de acuerdo con las pautas de manejo apropiadas. </li><li> La inducción de estrés oxidativo en embriones de pez cebra <ol><li> Preparar una solución oxidante por medicamentos genéricos de inducción de estrés oxidativo: Hacer 50 ml de solución oxidante mediante la adición de H 2 O 2 solución madre (peróxido de hidrógeno; 100 mM) al agua los peces. Utilice H 2 O 2 de una concentración final entre 2 mM y 100 mM. Preparar esta solución poco antes de su uso. La solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. No guarde esta solución. PRECAUCIÓN: H 2 O 2 es peligroso y nocivo por inhalación y por ingestión. El contacto con material combustible puede causar fuego. Manipular bajo una campana de humos y desgaste pers apropiadasequipo de protección onal. </li><li> Preparar una solución oxidante para las mitocondrias derivadas del estrés oxidativo por inducción: Haga una solución de oxidante (5 mM) por disolución de 3,9 mg de rotenona en 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad. <ol><li> Disolver la rotenona solución madre a 10 ml de agua de pescado para hacer una solución lista para usar. Utilice rotenona a una concentración entre 5-50 mM. No utilice rotenona a concentraciones superiores a 100 mM. A concentraciones apropiadas, esta solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. PRECAUCIÓN: La rotenona es tóxico y peligroso. Proceder conforme consejos de prudencia apropiados. </li></ol></li><li> Inducir el estrés oxidativo al gen knock-down: Knock-down expresión génica nrf2a en embriones de pez cebra mediante microinyección morfolino como se informó anteriormente por Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Inducir oxidAtive estrés después de daño tisular: generar un margen de la herida en la aleta de la cola de embriones de pez cebra a las 72 HPF como se ha descrito previamente por Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Preparar 5 ml de solución de ROS-detección de una sola célula método ROS-detección: <ol><li> Solución para la detección de ROS en general: Disolver la sonda molecular de ROS-sensible genérico en HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM). Esta solución debe prepararse poco antes de su uso. </li><li> Solución para la detección específica de ROS inducida por las mitocondrias: Poco antes de su utilización, se disuelven una sonda ROS-sensible mitocondrial con DMSO hacer una solución madre 5 mM. Disolver solución madre en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM). NOTA: Evite la luz y el oxígeno de la exposición de las soluciones de trabajo ROS-detección y sus respectivas soluciones madre. Evite que el tubo de la luz mediante el uso deuna lámina de aluminio. No almacene o reutilización sondas disueltos en HBSS. Guarde las soluciones madre a -20 ° C durante un mes. PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares y DMSO bajo una campana de humos de acuerdo con las directrices pertinentes. </li></ol></li><li> Preparar 5 ml de solución de ROS-detección para la totalidad del método de montaje de ROS-detección: Disolver la solución de la sonda de stock de ROS-sensible genérico (estabilizado en DMSO) en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-5 M). Evite la luz y la exposición al oxígeno. Evite que el tubo de la luz. Preparar esta solución antes de su uso. No almacene o volver a utilizar esta solución. PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares bajo una campana de extracción de acuerdo con las directrices pertinentes. </li><li> Hacer 25 ml de solución de parada mediante la adición de 10 ml de suero fetal bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenga solución estéril. Almacenar esta solución a 4 ° C. Se requiere esta solución sólo para una sola célula - método de detección de ROS. </li><li> Ajustar la incubadora de aire de pez cebra a 28 y# 176; C. </li><li> Establecer la centrífuga a 4 ° C para el método de ROS-detección de una sola célula. </li></ol> 2. El apareamiento de peces adultos y selección de embriones de pez cebra <ol><li> Set-up de adultos par pez cebra cruza acuerdo con protocolos estándar 40. Seleccione la línea transgénica apropiada de acuerdo con las necesidades experimentales específicas. </li><li> Recoger los huevos y colocarlos en un plato de 90 mm con medio de los peces de agua / embrión. Mantenga los huevos a 28 ° C hasta que los embriones se desarrollan y crecen a la etapa deseada del desarrollo (por ejemplo, 48 HPF, 72 HPF; HPF: horas después de la fecundación). </li><li> Pantalla para el desarrollo de los embriones. Excluir todos los óvulos no fertilizados o embriones subdesarrollados. </li><li> Anestesie embriones mediante la adición de 1 ml de tricaína (solución madre) en 50 ml de agua los peces. </li><li> Seleccionar embriones fluorescentes Tg bajo un microscopio estereoscópico. </li></ol> 3. Tratamiento de los embriones con el agente oxidante <ol><li> Utilice por lo menos 30 embriones entre las 48 hpf y 72 HPF por diferentes condiciones. Lavar dos veces con embriones de peces de agua dulce para eliminar tricaína. </li><li> Dividir embriones fluorescentes en tres platos. No coloque más de 30 embriones / plato. </li><li> Retire la solución de lavado y añadir 10 ml de la solución oxidante o 10 ml de agua de pescado como solución de control. </li><li> Incubar los embriones durante 10 min a 1 hora a 28 ° C. El período de incubación depende por el nivel de estrés oxidativo a ser inducida en tejidos específicos. Los períodos cortos son los mejores como las células afectadas por el estrés oxidativo sufren progresivamente la muerte celular. </li><li> Transferencia de embriones en un nuevo plato que contiene HBSS y embriones de lavado por agitación. Pre-HBSS caliente a 28 ° C. </li></ol> 4. Toda Método de detección de Mount ROS <ol><li> Recoger los embriones después del tratamiento oxidante y poner no más de 10 embriones en un pequeño tubo. Enjuague con HBSS tanto como sea posible. Evite que el tubo de la luz utilizando papel de aluminio. </li><li> Añadir 1 ml de solución de ROS-detección paracada tubo. </li><li> Incubar los embriones en la oscuridad durante 15 min a 28 ° C para evitar la exposición a la luz. </li><li> Durante el tiempo de incubación preparar un portaobjetos de vidrio para el análisis de embriones conjunto. Ponga 300 l de metilcelulosa en una &quot;depresión&quot; portaobjetos de vidrio y lo extendió sobre la superficie de cristal con una punta de pipeta. Evitar burbujas mientras que la liberación de la metilcelulosa. </li><li> Al final del tiempo de incubación, retirar inmediatamente la solución de ROS-detección y lavar dos veces con 2 ml de HBSS. Lavar embriones invirtiendo el tubo varias veces. No pipetear o vórtice. </li><li> Embriones Aspirar hasta en una pipeta Pasteur de vidrio. Posición embriones cerca de la abertura de la pipeta y suavemente les expulsan a la metilcelulosa. Orientar los embriones apropiadamente con una línea de nylon fino. </li><li> Comparar la fluorescencia del control de los embriones con embriones tratados. Alternativamente, fijar los parámetros del microscopio estereoscópico de fluorescencia o un microscopio confocal de modo que todos los embriones son imágenes utilizando el mismola configuración de imagen. </li></ol> 5. Single Cell Método de detección de ROS <ol><li> Comience desde el paso: 3.5. Asegúrese de tener al menos 35 embriones para cada condición. </li><li> Transferencia de embriones en un nuevo plato. Eliminar el agua los peces tanto como sea posible. Añadir 10 ml de helado de PBS 1x y 400 l de inhibidores de la proteasa Cocktail. Dechorionate manualmente embriones con unas pinzas y quite el saco vitelino con una aguja fina. Nota: Al eliminar el saco vitelino asegura muestras limpias para el siguiente análisis FACS. Este paso se puede evitar de acuerdo con instrumento de FACS. </li><li> Transferencia de embriones de-yema en un 24 y placa de múltiples pocillos (15 embriones / pocillo) y retire toda el agua los peces. </li><li> Añadir 300 l de HBSS, 30 l colagenasa P, 50 l de tripsina-EDTA en cada pocillo. </li><li> Homogeneizar embriones pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de punta estrecha (1.000 l). </li><li> Incubar a 28 ° C durante 20 min y homogeneizar las muestras mediante pipeteo cada 5 min. </li><li> Compruebe DISR tejidouption observando una alícuota del homogeneizado en el microscopio compuesto. Facilitar la suspensión de células individuales con la pipeta. No incubar embriones durante más de 30 min. </li><li> Detener la reacción añadiendo 200 l de solución de parada. Mezclar suavemente con la pipeta. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de pre-refrigerada con la parte inferior apretado. Mantener el tubo en hielo y evitar exposición a la luz. </li><li> Se centrifuga durante 5 minutos a 250 xga 4 º C. </li><li> Retire la fase superior y volver a suspender las células con el hielo frío HBSS pipeteando suavemente. </li><li> Contar las células y asegúrese de que tiene el mismo número de células en cada una de sus muestras. No utilice a menos de 2 x 10 6 células. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 250 x g a 4 ° C. </li><li> Extraer el sobrenadante y suspender el sedimento con 1 ml de hielo enfriado HBSS que contenía la sonda de ROS-sensible. </li><li> Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 3 min en la oscuridad. Variar tiempo de incubación de acuerdo con el nivel de estrés oxidativo y para tque la sensibilidad de la sonda. </li><li> Transferir las células a un tubo de FACS. Mantener los tubos en hielo y evitar exposición a la luz antes del análisis FACS. </li><li> Clasificar células con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Longitudes de onda fijada de conformidad con Tg fluorescencia tejido (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias) y los espectros de excitación / emisión de la sonda molecular utilizada para la detección de ROS (por ejemplo, las sondas de ROS mitocondriales sensibles específicos, sondas ROS-sensibles genéricos). </li><li> Para cada condición, medir todas las muestras dentro de la misma sesión de análisis, aplicando los mismos parámetros de FACS. Calcular el porcentaje de células fluorescentes como la media de los diferentes biológicos repeticiones. Analizar al menos dos réplicas para cada condición. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Pasos críticos El procedimiento para la detección de estrés oxidativo en embriones de pez cebra en el presente documento se describen comprende dos métodos diferentes. Todo el método de montaje de ROS-detección es principalmente un ensayo cualitativo para la detección de ROS-, mientras que el método de detección de ROS celular única permite mediciones cuantitativas más específicos (Figura 1). Ambos métodos ofrecen una forma rápida y fácil de evaluar vivo ROS...

El estrés oxidativo se define específicamente como una condición que resulta de un estado redox celular desequilibrada. Las complejas reacciones redox que ocurren de manera rutinaria dentro de las células determinan el estado redox celular. Las reacciones redox consisten en todas las reacciones químicas que consisten en la transferencia de electrones entre los átomos de las moléculas biológicas que producen la reducción y la oxidación de moléculas (es decir, reacciones redox). Estas reacciones son catalizadas por especies electrónicamente activadas (es decir, especies pro-oxidantes), que se caracterizan por una inestabilidad estructural extrema y la activación espontánea de electrones desequilibradas que intercambian con biomoléculas vecinos. Estas reacciones irregulares resultan en daño en el ADN, carboxilación de proteínas, y la oxidación de lípidos, y finalmente conducen a la muerte celular 1. Aumento de los niveles de estrés oxidativo se han asociado con el envejecimiento y la progresión de diversos estados patológicos 2. El estrés oxidativo tieneha informado que es responsable de alteraciones vasculares en la diabetes y enfermedades cardiovasculares 3,4. También juega un papel crítico en la degeneración neuronal en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson 5. Además, el estrés oxidativo se ha demostrado como un factor crítico en el gobierno de la progresión del cáncer y los acontecimientos metastásicos 6,7. Además, las respuestas inmunes y la inflamación pueden provocar y el estrés oxidativo más apoyo 8. En las células vivas, las especies pro-oxidativos derivan de oxígeno (ROS, especies reactivas de oxígeno) o nitrógeno (RNS, especies reactivas de nitrógeno). ROS incluyen el radical hidroxilo, el anión superóxido (OH). (O 2 -) y el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). El principal RNS es el óxido nitroso (NO.). Una serie de especies reactivas secundarias puede ser generada por interacciones espontáneas between de ROS y RNS o metales libres iones 9. Por ejemplo, el anión superóxido reacciona con el óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), mientras que H 2 O 2 reaccionar con Fe 2 + genera radicales hidroxilo. ROS y RNS, debido a su capacidad para reaccionar con varios biomoléculas, se consideran una amenaza peligrosa para el mantenimiento del estado redox fisiológica 10. Para mantener las células estado redox están equipadas con una serie de desintoxicación de moléculas anti-oxidantes y enzimas. La superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutatión peroxidasa y peroxirredoxinas constituye esencialmente el antioxidante enzimático-arsenal que proporciona protección celular a partir de especies pro-oxidantes incluyendo H 2 O 2, OH y OONO -. 11. También moléculas antioxidantes como la vitamina C y E, polifenoles y CoenzymeQ10 (CoQ10) son de importancia crítica para saciar ROS y su peligrosa derivatives 12,13. Sin embargo, una producción excesiva de ROS y RNS, o una disfunción en el sistema anti-oxidante, cambia el estado redox celular hacia el estrés oxidativo 14. Además de su connotación negativa, ROS puede desempeñar diversas funciones fisiológicas en células de origen diferente. Las células normalmente producen ROS como moléculas de señalización para mediar acontecimientos biológicos normales, tales como la defensa del huésped y la reparación de heridas 15-17. Normalmente las especies reactivas se producen en las células por las enzimas intracelulares tales como NOx (NADPH oxidasa) y XO (xantina oxidasa) en respuesta a factores de señalización, factores de crecimiento, y las fluctuaciones de los niveles de calcio intracelulares de 18,19. Se ha informado de que las ROS puede diferencialmente modular la actividad de los factores nucleares importantes tales como p53 o componentes celulares, tales como la ATM-quinasa, un regulador maestro de la respuesta al daño del ADN 20. Análogamente ROS influyen fuertemente en la señalización celular por mediación ªe oxidación e inactivación de proteína tirosina fosfatasas (PTP), que se establecen como reguladores críticos de la transducción de la señal 21. Por otra parte, las metodologías proteómicas basadas demuestran que RNS también son responsables de modificaciones y alteraciones de señalización molecular de proteínas específicas. RNS reaccionan con los grupos tiol de cisteína modificadores de ellos en S-nitrothiols (SNO) y desencadenantes vías moleculares concomitantes con estados patológicos tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunes 22,23. Desde los experimentos de cultivo de células se reproducen sólo parcialmente la multitud de factores que actúan in vivo, es de gran interés para llevar a cabo estudios redox en modelos animales 24,25. Para lograr esto, el pez cebra se ha considerado un modelo animal vertebrado adecuado para estudiar la dinámica de estrés oxidativo 26. El pez cebra es un nuevo modelo de sistema que otorga una serie de ventajas para el estudio de los eventos celulares y genéticos durante dev vertebradoselopment y la enfermedad. Grandes agrupaciones de embriones pueden ser generados y disponibles semanal para las necesidades experimentales. Además, la claridad óptica extraordinaria de embriones de pez cebra, así como su pequeño tamaño, permite imágenes de células única y el seguimiento dinámico en toda una organismos 27. En la última década, un número considerable de pez cebra mutantes se han generado para modelar las condiciones patológicas humanas, tales como el cáncer y enfermedades genéticas 28-31. Lo más importante, una multitud de líneas transgénicas ha sido producido para permitir amplias posibilidades de manipulaciones genéticas y biológicas 32. Por ejemplo, las líneas de pez cebra en tejidos específicos de transgénicos son utilizados regularmente por los estudios in vivo. Estas líneas expresan una proteína fluorescente bajo el control de un promotor seleccionado, ofreciendo la capacidad de identificar células individuales in vivo, así como la estructura anatómica que comprenden. Varios estudios toxicológicos ya han utilizado tque el pez cebra para evaluar el efecto in vivo de los productos químicos sobre la homeostasis redox, lo que sugiere la idoneidad de este vertebrado como un modelo animal para el campo del descubrimiento de fármacos y el estrés oxidativo 33-35. A pesar de que algunas sondas fluorescentes se han probado para controlar el estrés oxidativo en larvas de pez cebra 36,37, no hay ensayos establecidos para detectar y medir los niveles de estrés oxidativo en los tejidos del pez cebra y las células vivas. Aquí se describe un procedimiento para la cuantificación in vivo de estrés oxidativo en las células de embriones de pez cebra que viven. Herramientas de diagnóstico por imágenes, la separación FACS, sondas fluorescentes y las condiciones pro-oxidativos se combinan para generar un simple ensayo para la detección y cuantificación de especies oxidativas en los embriones y tejidos de pez cebra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden causar un cambio de estado redox celular hacia condiciones de estrés oxidativo. Esta situación provoca la oxidación de moléculas (lípidos, ADN, proteínas) y conduce a la muerte celular. El estrés oxidativo también afecta a la progresión de varias condiciones patológicas tales como la diabetes, retinopatías, la neurodegeneración, y el cáncer. Por lo tanto, es importante definir herramientas para investigar las condiciones de estrés oxidativo no sólo a nivel de células individuales, sino también en el contexto de organismos enteros. En este sentido, consideramos que el embrión de pez cebra como un útil sistema vivo en llevar a cabo este tipo de estudios y presentar un protocolo para medir in vivo de estrés oxidativo. Aprovechando fluorescentes sondas ROS y líneas fluorescentes transgénicos de pez cebra, se desarrollan dos métodos diferentes de medir el estrés oxidativo in vivo: i) un &quot;todo embrión método ROS-detección&quot; para la medición cualitativa de estrés oxidativo y ii) una &quot;una sola célula método de detección de ROS &quot;para mediciones cuantitativas de estrés oxidativo. En este documento, se demuestra la eficacia de estos procedimientos, aumentando el estrés oxidativo en los tejidos por agentes oxidantes y métodos fisiológicos o genéticos. Este protocolo se presta para pantallas adelante genéticos y ayudará relaciones dirección de causa-efecto de ROS en modelos animales de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, tales como trastornos neurológicos y cáncer.

Al aplicar el método aquí descrito, se puede medir fácilmente y detectar el estrés oxidativo (y los niveles de ROS) en tejidos de embriones de pez cebra. Después de cruzar el pez cebra adultos, se recogen los huevos y se dejan desarrollar a 28 ° C a 72 h después de la fertilización (HPF). Con el fin de inducir el estrés oxidativo, se proponen dos enfoques diferentes: 1) el tratamiento de los embriones con fuertes reactivos pro-oxidantes o 2) la promoción de la formación de ROS después de la lesión tisular. ...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K vistas.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Video: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...