Estos protocolos son significativos porque proporcionan pasos detallados para la validación de la potencia y la selectividad de los nuevos inhibidores del HAT, que son importantes herramientas de investigación y posibles terapias. Las técnicas demostradas en este video son fáciles de realizar y proporcionan información sobre los efectos de los inhibidores de HAT en la acetilación de histona global y regional. Permiten comprender la regulación epigenética de la expresión génica.
La atención a los detalles es fundamental. Es importante seguir los protocolos paso a paso. Comience preparando la reacción enzimática en un volumen de 10 microlitros dentro de un tubo PCR de 0,2 mililitros según las instrucciones del manuscrito.
A continuación, incubar la mezcla de reacción completa a 30 grados centígrados durante una hora en un ciclor térmico de PCR. Mientras tanto, agregue dos mercaptoetanol en una proporción de uno a 10 al búfer de muestra 6X SDS. Retire las muestras del ciclor térmico PCR y añada dos microlitros del búfer de muestra SDS preparado a cada mezcla de reacción.
Calienta las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos en un bloque de calor y luego enfríalas sobre hielo. Almacene las muestras en menos 20 o menos 80 grados Celsius o proceda con electroforesis de gel e inmunoblotting. Semilla 100.000 células MCF-7 en un mililitro de medio de cultivo celular en cada pozo de una placa de 12 pozos y permite que las células crezcan a 80 a 90% de confluencia.
Cuando las células alcancen la confluencia deseada, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos cuatro, cinco y seis, y pipetear un mililitro de tres micromolares MS275 en medio en cada pozo. A continuación, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos uno, dos y tres, y pipetear un mililitro de DMSO diluido en cada pozo. Devolver las células a la incubadora durante cuatro horas para permitir la acumulación de histonas acetiladas en las células expuestas a MS275.
Mientras las células están incubando, prepare diluciones de A-485 en DMSO de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez finalizada la incubación, aspirar el medio de los pozos y añadir las diluciones. Devolver las células a la incubadora y cultivarlas durante 20 horas, luego aspirar el medio de cultivo celular de los pozos y lavar las células con un mililitro de PBS.
Aspirar el PBS y añadir 100 microlitros de tampón de lelisis pasiva. Guarde la placa a menos 80 grados centígrados durante la noche. Pipetear 100 microlitros de cromatina sonicada de células tratadas con DMSO en dos tubos de 1,5 mililitros, luego pipetear 400 microlitros de tampón de dilución ChIP a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 microlitros.
Retire cinco microlitros de la solución de uno de los tubos y guárdelo a menos 20 grados Celsius como entrada DMSO. Preparar dos tubos con cromatina sonicada a partir de células tratadas con A-485 de la misma manera. Utilice una pipeta para añadir los anticuerpos acetil IgG y H3K27 a las muestras DMSO y A-485.
A continuación, agregue 20 microlitros de proteína A cuentas magnéticas a cada tubo, asegurándose de que las perlas estén bien resuspendidas. Gire las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Pele la proteína Un perla magnética usando un separador magnético y retire el sobrenadante sin alterar las perlas.
Lave las cuentas con 500 microlitros a un mililitro de tampón de lavado con bajo contenido de sal y gírelas durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Realizar un giro rápido hacia abajo, peletizar las perlas con un separador magnético y quitar el sobrenadante. Repita el procedimiento de lavado con tampón de lavado de sal alta, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón TE.
Después del lavado con tampón TE, retire las muestras de entrada del congelador y colóquelas en hielo. Descongelar una alícuota de proteinasa K, luego pele el cordón usando un separador magnético y retire el tampón TE de las perlas. Añadir 100 microlitros de tampón de elución ChIP y un microlitro de proteinasa K a cada muestra, incluidas las muestras de entrada, e incubarlas con agitación a 62 grados centígrados durante dos horas utilizando un termociclo.
Después de la incubación, calienta las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos, luego enfríelas a temperatura ambiente. Pele el punto magnético con un separador magnético y transfiera el sobrenadante que contiene ADN a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR estándar y ejecute qPCR.
El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa se utilizó para investigar el efecto del ácido anacardico en la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. Se probó un rango de concentración y no se añadió acetil-CoA a la reacción de control negativo. Los resultados de inmunoblotos se cuantificaron con ImageJ, mostrando una clara reducción en el acetil H3K18 y acetil H3K9 a 100 ácido anacardico micromolar en comparación con el control DMSO.
En el ensayo de inhibición de la hiperatilidad de la cromatina, el tratamiento de las células MCF-7 con HDACi MS275 fuertemente regulado acetillación de la histona 3 en varios residuos de lisina. Los niveles basales de acetil H3K18 y acetil H3K27 fueron bajos, mostrando los beneficios de agregar un HDACi en el ensayo ChHAI. La adición de A-485 en células pretratadas con MS275 atenúa el aumento de la acetilción de histona en H3K18 y H3K27, pero no H3K9.
Los resultados de inmunoblot también se cuantificaron con ImageJ. ChIP qPCR se utilizó para investigar los efectos de los inhibidores de HAT en elementos reguladores de genes que controlan la expresión de oncogén. En la muestra DMSO, el ADN precipitado por el anticuerpo de control IgG produjo un valor Ct más alto que el anticuerpo acetil H3K27 en la reacción qPCR para el promotor de la ciclina D1, lo que indica que el control IgG no específico precipitó menos complejos de histona de ADN que el anticuerpo específico de acetil H3K27 en el promotor.
En comparación con el control DMSO, A-485 redujo el enriquecimiento de acetil H3K27 en el promotor de la ciclina D1. Es importante destacar que se sabe que A-485 reduce significativamente el acetil H3K27 en el cultivo celular. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los pasos previos a la incubación de los ensayos IN vitro HAT y ChHAI son esenciales y no deben olvidarse.
También es importante recordar guardar las muestras de entrada y evitar la pérdida de las perlas durante ChIP. Después de realizar estos procedimientos, ChIP-seq es un método adicional que se puede ejecutar para obtener información global sobre la acetilación de histona en elementos reguladores para todo el genoma. Estos protocolos son útiles para que los científicos validen cuidadosamente nuevos inhibidores de HAT y eviten publicar sondas químicas de baja calidad en la literatura.
Los inhibidores de HAT validados pueden someterse a un desarrollo adicional como posibles terapias.
