La epilepsia es una enfermedad neurológica prevalente. Las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo representan la evolución epiléptica-como los acontecimientos que se asemejan in vivo a epilepsia y se pueden por lo tanto utilizar como modelo ex vivo del epileptogenesis. Este sistema es de hecho una excelente herramienta para monitorear la dinámica y la progresión de la epileptogénesis, así como para la detección de posibles dianas terapéuticas para esta patología cerebral.
Demostrando los procedimientos conmigo estarán mis alumnos Francisco Meda y Mafalda Carvalho. Para cosechar el cerebro de un día postnatal de seis a siete crías de Sprague-Dawley, primero lave la cabeza tres veces en cinco mililitros de GBSS. Trabajando en un gabinete de bioseguridad, inserte firmemente pórceps afilados en las cuencas oculares para mantener la cabeza en su lugar y use tijeras de punta delgada para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media desde el agujero vertebral hasta los lóbulos frontales.
Corte el cráneo de la misma manera y a lo largo de la fisura transversal cerebral y use fórceps largos curvos para separar las piezas del cráneo. Use una espátula para desechar los bulbos olfativos y transferir el lado dorsal del cerebro hacia arriba en una placa de 60 milímetros que contiene cinco mililitros de GBSS frío. Inserte las órceps finas en el cerebelo e inserte la espátula a lo largo de la línea media para abrir cuidadosamente el hemisferio.
Use fórceps curvos cortos para eliminar cuidadosamente el exceso de tejido que cubre el hipocampo sin tocar la estructura del hipocampo, luego corte debajo de cada hipocampo. Transfiera un hemisferio a la vez el hipocampo hacia arriba y paralelo entre sí en un pedazo de papel de filtro. Coloque el papel de filtro en un helicóptero de tejido con los hemisferios perpendiculares a la hoja y corte los hemisferios en rodajas de 350 micras.
Transfiera el tejido cortado en rodajas a una nueva placa de Petri que contenga cinco mililitros de GBSS frío y use electrodos de punta redonda para separar cuidadosamente las rebanadas manteniendo solo las muestras con una corteza rinal e hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas dg y ca deben definirse perfectamente, así como las regiones de la corteza entorrinal y perirhinal. Use una espátula y un electrodo de punta redonda para colocar hasta cuatro rebanadas intactas en inserciones individuales en el número apropiado de pozos de una placa de seis pozos que contenga 1.1 mililitros de medio de cultivo por pozo.
Utilice una pipeta P20 para eliminar cualquier exceso de medio de disección de alrededor de cada rebanada. Coloque el plato en la incubadora de cultivos celulares. Cambie el medio cada dos o tres días.
Utilice las subapas para levantar el inserto. Aspirar el medio desde el pozo correspondiente y volver a colocar el inserto en su lugar. Use una pipeta P1000 para agregar un mililitro de medio fresco de 37 grados Celsius a cada pozo.
Prepare la configuración de electrofisiología en un circuito cerrado. Verifique que el caudal de la cámara de tipo de interfaz esté establecido en dos mililitros por minuto y abra la válvula de buey de carbohidratos. Compruebe el nivel de agua en el sistema y coloque un trozo de papel de filtro en la cámara de grabación de la interfaz para drenar cualquier exceso de medio.
Coloque un pedazo de papel de limpieza de lente debajo del marco para suministrar el medio a la rebanada y encienda el controlador de temperatura, los amplificadores y los micro manipuladores. Use una jeringa para cargar un electrodo de vidrio con líquido cefalorraquídeo artificial recién preparado. Coloque el electrodo de vidrio en el electrodo receptor y espere a que la temperatura en la cámara de interfaz se estabilice a 37 grados Celsius.
Trabajando en un gabinete de bioseguridad, coloque el inserto en una placa de 60 milímetros con una gota de medio. Use una cuchilla afilada para cortar una rebanada de la inserción y coloque la rebanada en la cámara de interfaz con el hipocampo en la parte inferior derecha, luego coloque el electrodo receptor en la capa de celda piramidal CA3, inicie el protocolo de adquisición continua y registre la rebanada durante 30 minutos. Para realizar el ensayo de absorción de yoduro de propidio, trabaje en un gabinete de bioseguridad.
Levante el inserto del pozo y agregue yoduro de propidio en medio a una concentración final de dos micromolares por pozo. Agitar lentamente la placa antes de colocar el inserto de nuevo en el pozo, teniendo cuidado de que no haya burbujas debajo de las rebanadas. Cuando todas las rebanadas hayan sido tratadas, devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares.
Para la inmunotensión de las rodajas, al final de la incubación de yoduro de propidio, aspirar el medio desde la parte inferior de cada pozo y añadir un mililitro de paraformadehído al 4% en la parte superior e inferior de cada inserto. Después de una hora a temperatura ambiente, lave las rebanadas dos veces durante 10 minutos y un mililitro de PBS por lavado y use una pluma hidrofóbica para dibujar dos rectángulos en los portaobjetos del microscopio. Utilice una hoja afilada para cortar las rebanadas de las inserciones y coloque una rebanada en cada rectángulo.
Agregue la solución de bloqueo de permeabilización en cada rebanada para una incubación de tres horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue los anticuerpos primarios de interés a cada rebanada para una incubación de cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, lave las rodajas con PBS-Tween tres veces durante 10 minutos por lavado e incube las rodajas con los anticuerpos secundarios apropiados durante cuatro horas a temperatura ambiente.
Después, lave las rodajas como se ha demostrado y agregue 50 microlitros de solución de Hoechst a cada rebanada para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de Hoechst, lave las rodajas de nuevo y agregue 50 microlitros de medio de montaje a cada una, luego coloque un cubrebocas sobre las rebanadas y selle con esmalte de uñas. Después de permitir que los portaobjetos se sequen durante 24 horas a temperatura ambiente, visualice la inmunotensión y la absorción de yoduro de propidio mediante microscopía confocal.
Las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo representan la actividad interictal e ictal-como mezclada en siete días in vitro. A los 14 días in vitro, la actividad espontánea se caracteriza por descargas ictales, que evolucionan a una actividad ictal abrumadora a los 21 días in vitro con eventos ictales que duran más de un minuto. La absorción del yoduro del propidium y immunohistochemistry contra el marcador neuronal NeuN revelaron una cierta muerte neuronal en las rebanadas ines vitro de siete días que se aumenta considerablemente en 14 días in vitro en todas las áreas del hipocampo.
A los siete días in vitro, las microglías ramificadas con una baja expresión de CD68 son más abundantes que la microglía reactiva cd68 positiva de Iba1. Mientras que a los 14 días in vitro, en todas las áreas del hipocampo, iba1 positivo CD68 positivo ameboide M1 microglía superar la microglía con una baja expresión de CD68. A los 14 días in vitro, algunas células CD68 positivas de Iba1 con un aspecto de hiper ramificación pueden ser precisadas, lo que sugiere la posibilidad de un fenotipo de microglía antiinflamatoria M2.
A los siete días in vitro, la expresión de CD3 es apenas detectable, mientras que en rodajas in vitro de 14 días se pueden observar astrocitos positivos de proteína ácida fibrilosa hipertrófica CD3 positiva, lo que sugiere una activación progresiva de los astrocitos A1. Prepare rodajas de corteza rinal-hipocampo con extremo cuidado. Asegúrese de eliminar el exceso de tejido por encima del hipocampo, ya que puede comprometer la integridad de la rebanada durante el corte.
El déficit estructural tendrá un impacto negativo en la viabilidad de los cortes. Además de los acercamientos demostrados, una plétora de análisis tales como análisis de la mancha blanca /negra occidental, polimerización en cadena en tiempo real y ELISA se puede aplicar a este sistema para dirigir preguntas específicas con respecto a epileptogenesis.
