Damos las gracias a Martine Emond y Brachmann Isabel por su ayuda en el establecimiento del sistema de corte y la cultura organotípicos Wolfgang Hübner y Liviu Gabriel Bodea para la lectura crítica del manuscrito. Nos gustaría dar las gracias a Frank Costantini para el R26 ratones reportero y Tabin Acantilado de los ratones CREER Shh. Este estudio fue financiado por un Premio de Investigación del Ministerio de Ciencia e Investigación del Norte-Westfalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Partes de este protocolo se modifican de Daza et al., 2007 7. 1. Preparativos <ol><li> Se puede preparar con un día de antelación <ol><li> Preparar 1X buffer Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM de glucosa, 25 mM NaHCO 3; ajustar el pH a 7.4. Filtro de esterilización (0,22 micras de tamaño de poro) y almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar el medio de cultivo (20 ml): 5 ml de HBSS, 9 ml de glucosa en DMEM alto, 850 l de glucosa al 30%, 5 ml de suero de caballo (25%). Añadir 200 l 100X penicilina / estreptomicina. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar antes de comenzar la disección <ol><li> Preparar 100 ml de 4% de agarosa de baja fusión (LMP agarosa) en 1X buffer Krebs: la solución de microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo y luego coloque la agarosa en un baño de agua a 45 ° C. </li><li> Llene la vibraciónTomé la bandeja de búfer con helado de buffer 1X Krebs y de apertura del elemento de refrigeración (mantener a 4 ° C). Fijar una hoja de afeitar en el portador de la cuchilla y la puesta en marcha de la zona vibratome con un bisturí, un pincel fino y con una cuchara perforada pequeño para recoger los trozos. Preparar placas de Petri estériles (35 x 10 mm) con 1x buffer Krebs para recoger los trozos. Mantener en hielo. </li><li> Puesta en marcha del área de disección con placas de Petri estériles (100 x 15 mm) para la disección y pequeñas placas de Petri estériles (35 x 10 mm) para incrustar, tijeras pequeñas, dos pinzas finas (Dumont 5), una cuchara perforada mini, un vaso Pasteur fuego pipeta pulida con una ronda cerró la punta y 1 l de 1x tampón de Krebs en el hielo. Limpie todas las herramientas de disección con etanol al 70%. </li><li> Añadir medio de cultivo a los pocillos de una placa de seis pocillos (1,5 ml / pocillo) y colocarlo en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Preparar una placa de seis pocillos con 1,5 ml / pocillo estéril 1X buffer Krebs y 15 l penicilina / estreptomicina (100X) y /. En condiciones estériles, lugar Millicell insertos de cultivo celular en los pocillos. Colocar la placa de seis pozos al lado de la vibratome para que las rodajas de cerebro pueden ser transferidos a las membranas de filtro inmediatamente después de la sección. </li></ol></li></ol> 2. La disección y la incorporación de los cerebros de embriones <ol><li> Anestesiar a un ratón hembra embarazada con el isoflurano y el sacrificio del ratón por dislocación cervical (embriones debe estar en fase E12.5). Diseccionar el útero del ratón tirando hacia arriba del útero con una pinza. Use unas pinzas para separar el otro mesometrio fuera del útero. Coloque el útero en helado 1X tampón de Krebs. Use unas pinzas finas para separar la pared muscular del útero, la membrana de Reichert y el visceral saco vitelino del embrión. La toma de embriones del útero. Colocar los embriones disecados en un aparte con placa de Petri estéril 1X buffer Krebs. </li><li> Diseccionar el cerebro bajo un microscopio estereoscópico. Para diseccionar el cerebro, el primero le cortó la cabeza del embrión. Fijar la cabezapor la perforación de unas pinzas finas a través de la cabeza (altura de los ojos). Utilice otro par de pinzas para retirar con cuidado la piel y el cráneo. Use unas pinzas para levantar cuidadosamente el cerebro a cabo y la transfiere en una placa de Petri estéril con buffer 1X Krebs. Es muy importante que la integridad de todo el cerebro se mantiene durante la disección, ya que los daños en el tejido cerebral va a crear problemas (por ejemplo, romper papeles) durante el corte en el vibratome. </li><li> Lavar el cerebro de vez en bajo punto de fusión del 4% (LMP) de agarosa. Insertar 2-3 cerebro en un momento dulce en el 4% de agarosa LMP. Coloque los platos incrustación en el hielo lo más uniforme posible. Utilice una pipeta Pasteur con una punta redonda pulida al fuego para levantar el cerebro hasta la parte inferior de la agarosa se solidifica. El cerebro debe instalarse en una posición plana horizontal en la parte inferior del bloque de agarosa. </li><li> Después de la agarosa ha solidificado completamente (después de aproximadamente 3 min), recorte la agarosa que rodea el cerebro y la cola del bloque de agarosa al escenario muestrade la vibratome. Al pegar los bloques, asegúrese de que la parte ventral del cerebro es paralelo a la plataforma, ya que el cerebro debe ser cortado en un plano de sección horizontal. </li></ol> 3. Vibratome corte <ol><li> Use una hoja de afeitar para cortar. Para obtener rebanadas intactas es muy importante para mantener la temperatura a 4 º C durante el corte. </li><li> Sección 300 micras de espesor cortes horizontales a una frecuencia de 50 Hz, la amplitud de la hoja de 1,1 mm y una velocidad de 25 mm / seg. </li><li> Utilice el pincel fino para empujar el corte en una cuchara perforada pequeño para recoger los cortes de cerebro y transferirlos en un plato con agua estéril buffer helada 1X Krebs. Elija el segmento que contiene tejido del cerebro medio ventral (ver Figura 1). En un cerebro de ratón E12.5 no es sólo una rebanada 300 m horizontal que contiene tejido del cerebro medio ventral incluyendo las neuronas dopaminérgicas. </li></ol> 4. Cortar la cultura Pasos 4.2-4.5 debe llevarse a cabo en condiciones estériles. <ol><li> La transferencia de las rodajas de cerebro en una inserción de células Millicell membrana cultura en una placa de seis pocillos con 1x buffer Krebs (véase el punto 1.2.5). Para transferir la porción con la cuchara perforada pequeño (Herramientas Artes Ciencias) y un pincel fino. Hasta 3 rebanadas se pueden colocar en una membrana. </li><li> Transferencia de la membrana con el sector a la placa de seis pocillos con medio de cultivo (véase el punto 1.2.5). La parte superior de la membrana no debe ser cubierto por medio. Los cortes de cerebro recibe soporte desde abajo y el aire desde arriba. </li><li> Colocar la placa de seis pozos en una incubadora con 5% de CO 2 a 37 ° C. Es muy importante que las rodajas se colocan en la incubadora a las 2 horas después de la etapa inicial de la disección. A más tiempo de preparación prolongado puede resultar en la supervivencia de los pobres de las rebanadas. </li><li> Rebanadas se pueden mantener in vitro hasta 3 días. 50% de cambio del medio de cultivo en el 2 º día. </li></ol><ol><li> Vamos a recuperar las rebanadas en la incubadora por 4-5 horas antes de la hora de inicio de imágenes a intervalos. </li><li> Para time-lapse, mantener los cortes en la inserción de membrana y la transferencia de la inserción en un 35 mm ibidi μ-plato (la parte inferior del plato se compone de un material con una alta calidad óptica). </li><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo, más 1,5 l de ácido ascórbico (200 mM) al plato. El ácido ascórbico protege contra las rodajas de fototoxicidad. </li><li> Incubar las rebanadas en una cámara climática a 37 º C con CO2 al 5% durante el time-lapse. </li></ol> 6. Resultados representante La Figura 1 ilustra la preparación de cultivos rebanada organotípicos de cerebro de ratón E12.5. La figura 2 muestra horizontal rodajas organotípicos (aguda y después de varios días en la cultura) obtiene a partir de E12.5 cerebro del ratón. Por comparación, las secciones del cerebro congelado en las etapas de desarrollo equivalentese muestran. Las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo se visualizan con la inmunohistoquímica para la tirosina hidroxilasa (TH). Mesencéfalo neuronas dopaminérgicas a los objetivos del proyecto en el cerebro anterior. Estas proyecciones comienzan a formarse en E12.5 y se extienden hacia el cerebro anterior durante los días posteriores. Consideramos que el desarrollo de las proyecciones del cerebro anterior como una buena indicación para el desarrollo normal de las neuronas dopaminérgicas en la cultura. En el mesencéfalo cortes horizontales a las neuronas dopaminérgicas se extienden proyecciones hacia su área adecuada objetivo del prosencéfalo. Después de 3 DIV (días in vitro) o cuando las zonas de intervención del cerebro anterior están dañados, las proyecciones aberrantes se extienden hacia el cerebro medio dorsal. Ejemplos de cortes coronales del cerebro medio E12.5 se muestran en la Figura 3. Las neuronas dopaminérgicas visualiza con inmunotinción para TH extender proyecciones aberrantes hacia el cerebro medio dorsal. La figura 4 muestra un análisis de la proliferación, las células necróticas y apoptosis en los cultivos de corte organotípicos. BrdU immunostaining para visualizar las células que proliferan demuestra que las células proliferan en condiciones de cultivo después de un DIV. Proliferación se reduce después de 4 DIV. Después de 3 DIV, muchas células en el cerebro medio ventral sufrir necrosis (tinción con yoduro de propidio) y apotosis (inmunotinción para exfoliados caspasa-3). Figura 5 muestra las rutas migratorias de YFP-etiquetados neuronas control en un experimento de time-lapse en un corte agudo . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que ilustra la preparación de cultivos rebanada organotípicos. 300 micras rodajas de cerebro horizontal son preparados por el corte de un cerebro con una vibratome E12.5. (A) Esquema sagital de un cerebro de ratón E12.5. Los niveles de las secciones se indican. El área que contiene las neuronas dopaminérgicas se representa en color rosa, las proyecciones se indican en azul. (B) Esquema de los tres sectores que se pueden obtener de dorsal a ventral y that contienen cerebro anterior (Fb) y el cerebro medio (Mb). Tenga en cuenta que sólo una porción contiene neuronas dopaminérgicas (b rebanada). El corte adecuado se pueden identificar sobre la base de la posición de los ventrículos y la continuidad de los tejidos del cerebro medio y el prosencéfalo (flechas, comparar la sección B de la sección A y C). El área que contiene las neuronas dopaminérgicas se indica en color rosa, el área que contiene precursores dopaminérgicos se muestra en las flechas verdes, azules indican las proyecciones de desarrollo. (C) El segmento que contiene las neuronas dopaminérgicas se cultiva en las inserciones de la membrana. Abreviaturas: mesencéfalo VMB, ventral, DMB, mesencéfalo dorsal; Hyp, el hipotálamo, Hb, rombencéfalo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> Figura 2. Las proyecciones de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo en cultivos de corte organotípicos dependen de la integridad del cerebro anterior. Inmunohistoquímica para la tirosina hidroxilasa (TH) para marcar las neuronas dopaminérgicas. (A) corte aguda (0 DIV)que muestra la ubicación normal de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo ventral. La punta de flecha blanca indica el área que se muestra en un aumento mayor en el recuadro. Las proyecciones para el cerebro anterior aún no han desarrollado. Después de un DIV, las proyecciones en el cerebro anterior se empiezan a formar. Las proyecciones se extienden hacia el cerebro anterior de 2-3 DIV. Puntas de flechas blancas indican la ubicación de los cuerpos celulares se muestra en un aumento mayor en las inserciones (recuadro blanco). Las flechas amarillas destacan las proyecciones normales en rodajas intacta se muestra en un aumento mayor en las inserciones (cuadro amarillo). Proyecciones aberrantes se desarrollan en rodajas de cerebro anterior con daños. Las flechas rojas indican las proyecciones aberrantes hacia el cerebro medio dorsal se muestra en un aumento mayor en las inserciones (recuadro rojo). Los daños se indica con un asterisco rojo. Después de 3 DIV, la mayoría de los cortes (n = 5 / 7) tenía proyecciones aberrantes hacia el cerebro medio dorsal. (B) inmunotinción TH en secciones horizontales cerebro congelado en las distintas fases para mostrar el desarrollode las proyecciones dopaminérgicas en vivo. Puntas de flechas blancas indican la ubicación de los cuerpos celulares se muestra en un aumento mayor en las inserciones (recuadro blanco). Las flechas amarillas resaltar la posición de las proyecciones que figuran en un aumento mayor en las inserciones (cuadro amarillo). El nivel de las secciones de congelados fue elegido para corresponder con el nivel de las culturas rebanada organotípicos. Tenga en cuenta que una sola secciones congeladas (12 micras) no representa la rebanada completa organotípicos (300 micras). Por lo tanto, las proyecciones muestran en E13.5 E14.5 y se observaron en los artículos 120 micras más ventral de la sección que contiene los cuerpos celulares (asterisco amarillo). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> Figura 3. Mesencéfalo culturas coronal parte manchada de la tirosina hidroxilasa (TH) como marcador de las neuronas dopaminérgicas. (AC) Rebanadas después de DIV 1, 2 o 3. Las neuronas dopaminérgicas desarrollar proyecciones aberrantes hacia el cerebro medio dorsal (rflechas ed). Puntas de flecha indican la situación de los cuerpos celulares dopaminérgicos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> Figura 4. Proliferación celular y la viabilidad celular en cultivos de mesencéfalo rebanada organotípicos. (A) Las células en crecimiento fueron etiquetados por la adición de BrdU (50 ng / ml, Sigma) al medio de cultivo durante 18 h. Los cortes se immunostained posteriormente para BrdU. Después de un DIV, las células BrdU marcado se encuentran en las zonas del ventrículo izquierdo (flechas rojas). Después de 4 DIV, la proliferación de células son más dispersos y una zona ventricular distintas se mantiene por más tiempo. (B) Las células necróticas fueron etiquetados por la adición de yoduro de propidio (1μg/μL, Sigma) al medio de cultivo durante 2 horas y se visualizan por microscopía de fluorescencia. Después de un DIV, el mesencéfalo ventral (BV) no es necrótico, pero muchas células con yoduro de propidio etiqueta se puede ver en el mesencéfalo y el prosencéfalo dorsal. Después de 3 DIV disminuye la viabilidad celular en el midbra ventralin Barra de escala: 500 mm (c) Immunostaing para exfoliados caspasa-3 para visualizar las células apoptóticas. En 1 o 2 DIV, las neuronas dopaminérgicas sólo unos pocos (TH) son apoptóticas. Después de 3 DIV, las neuronas dopaminérgicas comenzar a someterse a la apoptosis. Paneles en el centro y la derecha son mayores aumentos de la zona de caja en los paneles de la izquierda. Las imágenes mayores aumentos son proyecciones de máxima intensidad de la z-pilas de 14-16 frames. Las imágenes fueron tomadas cada 0,5 m con una apótoma Zeiss set-up. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> Figura 5. Ruta migratoria de YFP marcado con las neuronas en una parte aguda. (A) Corte horizontal utilizada para la imagen de lapso de tiempo de YFP-etiquetados neuronas. El corte se incubó durante 5 horas antes de la imagen. Las células fueron marcadas con una inducible Cre / loxP del sistema 6. Shh ratones CREER 8 y ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP 9 ratones reportero quevolver a utilizar. La recombinación de los alelos periodista ROSA (y la expresión EYFP) se induce en las células que expresan CREER (Shh-que expresan las células), pero sólo después de la administración de tamoxifeno (Sigma). En este ejemplo, el tamoxifeno (3 mg/40 g de peso corporal) se administró a ratones gestantes a E8.5. Este montaje experimental los resultados sobre todo en el etiquetado de los precursores de las neuronas dopaminérgicas y sus descendientes en el mesencéfalo ventral 10,11. Barra de escala: 500 micras. (B) Seguimiento de la ruta migratoria de YFP marcado con las neuronas en una parte aguda. Time-lapse imágenes de YFP-etiquetados neuronas destino asignado se adquirieron cada 30 minutos durante un tiempo total de 5 horas y 30 minutos en un Zeiss Axio-observador microscopio (objetivo de la CE PlnN 10x / 0,3). Los cortes se incuban en una cámara ambiental (incubadora XLS1 Pecon) a 37 ° C y se suministra con 5% CO 2 durante el estudio. La posición inicial de las células está marcada con flechas rojas, las posiciones de migración están marcados con un asterisco rojo.

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	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El método slice cultura organotípicos presentada aquí, proporciona un sistema para el corto plazo en el desarrollo de análisis in vitro de neuronas dopaminérgicas y sus rutas migratorias y la proyección en el mesencéfalo ventral embrionario. Hemos encontrado que hay una serie de pasos críticos en el protocolo que debe ser cuidadosamente atendidos para obtener cortes que permiten el desarrollo normal de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral. El paso más crítico es la disección...

Tabla de reactivos y equipos específicos <table border="1"><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa al 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de caballo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Con L-Glu, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 100 veces </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> preparar acciones de 200 mm y almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure agarosa LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicel insertos </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-plato de 35 mm, de baja </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Hoja de afeitar </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl pegamento </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Dia cuchara perforada de diámetro 15 mm </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de 5 Dumoxel </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Los anticuerpos utilizados para immunostainings: <table border="1"><tr><td&gt; Nombre del anticuerpo </td><td> Empresa </td><td > Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> De conejo anti-tirosina hidroxilasa </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Dilución 1:500 </td></tr><tr><td> Mouse anti-tirosina hidroxilasa </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Dilución 1:500 </td></tr><tr><td> Ratón anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Dilución de 1:200 </td></tr><tr><td> De conejo anti-exfoliados caspasa 3 </td><td> Señalización Celular Tecnología </td><td> 9661 </td><td> Dilución de 1:200 </td></tr><tr><td> Burro anti-IgG de conejo-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Dilución 1:500 </td></tr><tr><td> Burro anti-IgG de ratón-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Dilución de 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

El ratón es un organismo modelo excelente para estudiar el desarrollo del cerebro de mamíferos debido a la abundancia de datos moleculares y genéticos. Sin embargo, el cerebro del ratón en desarrollo no es adecuado para una fácil manipulación y de imágenes en vivo desde el embrión de ratón es inaccesible y opaco. Cultivos organotípicos trozo de cerebro embrionario, por lo tanto ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo del cerebro murino in vitro. Ex-vivo la manipulación o el uso de ratones transgénicos que permite la modificación de la expresión génica a fin de que las subpoblaciones de células neuronales o gliales pueden ser etiquetados con proteínas fluorescentes. El comportamiento de las células marcadas se puede observar mediante time-lapse de imágenes. Time-lapse de imágenes ha sido particularmente exitoso para el estudio de los comportamientos celulares que subyacen en el desarrollo de la corteza cerebral en las últimas etapas embrionarias 1-2. Embrionarias sistemas organotípicos cultura de división en regiones del cerebro fuera del cerebro anterior se estableci menoshed. Por lo tanto, la riqueza de los datos de time-lapse de imágenes que describen la migración de las células neuronales se limita al cerebro anterior 3,4. Todavía no se conoce, si los principios descubiertos por el cerebro dorsal son válidas para las áreas del cerebro ventral. En el cerebro ventral, las neuronas se organizan en grupos neuronales en lugar de capas y muchas veces tienen que someterse a complicadas trayectorias migratorias para alcanzar su posición final. El cerebro medio ventral no sólo es un buen modelo de sistema para el desarrollo cerebral ventral, pero también contiene poblaciones neuronales, tales como las neuronas dopaminérgicas que son relevantes en los procesos de enfermedad. Mientras que la función y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas se ha investigado en gran detalle en el adulto y el envejecimiento del cerebro, se sabe poco sobre el comportamiento de estas neuronas durante su diferenciación y la fase de migración 5. Se describe aquí la generación de culturas de corte a partir del día embrionario (E) 12,5 mesencéfalo ventral del ratón. Estos culto rebanadadas son potencialmente adecuados para vigilar el desarrollo de neuronas dopaminérgicas en varios días in vitro. Se destacan los pasos críticos en la generación de cortes de cerebro en las primeras etapas del desarrollo embrionario y discutir las condiciones necesarias para mantener el desarrollo normal de las neuronas dopaminérgicas in vitro. También se presentan los resultados de los experimentos de imagen en tiempo transcurrido. En estos experimentos, los precursores del mesencéfalo ventral (incluidos los precursores dopaminérgicos) y sus descendientes fueron etiquetados en forma de mosaico con un Cre / loxP destino basado inducible sistema de mapeo 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

17.8K vistas.  University of Bonn. Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...