Bu protokol, sertlik, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matriks özelliklerinin tam olarak uygun maliyetli ve kolay bir şekilde kontrol edilebildiği bir hücre kültürü platformu sağlar. Yöntem uygun maliyetlidir ve özel eğitim veya tesisler gerektirmez. Ayrıca immünoresan boyama ve batı leke gibi birden fazla hücresel nicelik yöntemleri ile uyumludur.
Bu teknik Schwann hücre biyolojisi mekanistik bir anlayış sağlar. Sinir sistemi rejenerasyonu için biyomalzeme tasarımı içine ek anlayış ile, herhangi bir ankraj bağımlı hücrelere uygulanabilir. Bu protokolün en zorlu kısmı, mikrotemas baskı.
Protokolün başlangıcından önce, proteini etiketlemek için bir floresan kullanarak substrat üzerine mikrotemas baskısı, desendeki son baskıyı görsel olarak doğrular. PDMS baz elastomerve kür ajanlarını pipet ucuyla karıştırarak başlayın, kabarcıklar karışım içinde homojen bir şekilde dağılına kadar. Sonra vakum desiccation ile kabarcıklar kaldırın.
Kurutulmuş PDMS karışımından bir damlayı kare veya dairesel bir kapak kaymasına yerleştirin ve coverslip'i 2, 500 rpm'de 30 saniye boyunca döndürün. Kapak kapağını 60 derecede, bir ila iki saat veya bir gece oda sıcaklığında bir fırında kuluçkaya yatırın. Mikro desenli bir substrat hazırlamak için, 15 milimetre yüksekliğinde Petri çanak dairesel 150 milimetre çapında içine desenli silikon gofret yerleştirin ve gofret üzerine gazdan arındırılmış PDMS dökün.
PDMS'yi bir gecede 60 derecede fırında katılaştırdı. PDMS'nin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Sonra silikon gofret zarar vermemeye dikkat ederek doğru desenler içeren 30 tarafından 30 milimetre kareler pulları kesmek için bir cerrahi neşter kullanın.
PDMS pullarını ve ayarlanabilir kapak fişlerini 30 dakika boyunca %70 etanolle batırarak sterilize edin. Mikro desenin etkinliğini doğrulamak için, pulun tüm desenli tarafını kapsayacak şekilde filtrelenmiş hava akımı ve mililitre BSA çözeltisi başına pipet 15 mikrogram kullanarak PDMS pullarının yüzeyini kurulayın. Protein adsorpsiyonuna izin vermek için oda sıcaklığında bir saat bsa solüsyonu ile pulları kuluçkaya yatırın, ardından BSA çözeltisini çıkarmak için pulları hava kurutun.
Ayarlanabilir kapak fişlerinin yüzeyini kurutmak için filtrelenmiş hava akışını kullanın. Pulun desenli tarafını, kapak yüzeyinde BSA adsorpsiyonuna izin vermek için ayarlanabilir kapak lı kapaklı ile conformal temasa getirin ve pulu coverslip'e beş dakika boyunca hafifçe bastırın. FITC filtreli floresan mikroskobu kullanarak mikro deseni inceleyin.
Floresan desenler yerine hücre yapışkan alanları yazdırmak için BSA proteini için laminin yerine. Kapak fişlerinden pulları çıkarın ve kapak fişlerini sterilize edilmiş altı kuyulu bir tabağa aktarın. Kapak kayma yüzeyini kapsayacak şekilde her kuyuya % 0.2 Pluronic F-127 çözeltisi iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca plaka kuluçka.
F-127 çözeltisini aspire edin ve kapak fişlerini beş kez PBS ile yıkayın, bir kez hücre kültürü ortamı ile, sonra Schwann hücrelerini santimetre kare1000 hücre lik bir tohumlama yoğunluğunda tohumlayın. Hücre tohumlamadan 45 dakika sonra, hücre kültürünü n içini kaldırın ve birden fazla hücrenin aynı modele yapışmasını önlemek için kapak fişlerini PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri nicelemeden önce 48 saat boyunca istenilen hücre kültürü ortamında koruyun.
Hizalanmış hücreleri incelemek için çizgi desenli hücre kültürü yüzeyleri oluşturmak için, pulları el yazması yönlere göre yapın ve istenilen boyutlara doğru kesin. Daha önce açıklandığı gibi ayarlanabilir BIR PDMS yüzeyi ile kaplanmış iki Petri çanak hazırlayın ve tabaklardan birine çizgi desenli hücre yapıştırıcı alanlarını yazdırmak için mikro temaslı baskı yapın. Pulları çıkardıktan sonra Petri kabını %0,2 pluronic F-127 çözeltisinin dört mililitresi ile doldurun ve bir saat kuluçkaya yatırın.
PDMS damgasının her iki tarafını %70 etanolile üç kez durulayın ve havayla kurulayın. PDMS damgalarını döndürün ve daha önce açıklandığı gibi ikinci Petri kabına desensiz hücre yapıştırıcı alanını yazdırın. F-127 solüsyonu ile bulaşıkları kuluçkaya yatırdıktan sonra, çözeltiyi çıkarın ve pbs ile üç kez ve bir kez taze hücre kültürü ortamı ile yıkayın.
Daha sonra tabakların üzerine tohum hücreleri ve lysates hazırlamadan önce 48 saat boyunca istenilen koşullarda muhafaza. Lysates hazırlamak için, iki dakika boyunca buz gibi PBS ile hücreleri yıkayın, sonra her hücre yapışkan alana, el yazması talimatlara göre hazırlanan RIPA çözeltisi 80 mikrolitre ekleyin ve 25 dakika boyunca bir buz bloğu üzerinde hücreleri kuluçka. Schwann hücrelerini hücre kazıyıcısıyla beş dakika kazıyın ve lysat'ı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
12 bin kez G ve dört santigrat derece 15 dakika lysate santrifüj. Supernatant toplamak ve temiz bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Lamina kaplı substratlar kollajen ve fibronektin kaplı substratlara göre daha yüksek proliferasyon oranı ile sonuçlandı.
Lamina kaplamalı ve farklı modülli substratlarda bulunan Schwann hücreleri, nispeten daha yumuşak yüzeylerin hücre çoğalma oranlarını azalttığını göstermiştir. Hücreler de protein ekspresyonu için analiz edildi. Transkripsiyonel faktör c-Jun ekspresyonu substratlar daha yumuşak hale geldikçe yükseltildi.
Ancak, yumuşak yüzeylerde önemli ölçüde aşağı düzenlenmiştir. Sert yüzeylerde, kollajen kaplı yüzeyler en yüksek c-Jun ifadesi ile sonuçlandı, substratlar daha yumuşak hale geldikçe, laminin c-Jun'un en yüksek seviyelerini gösterdi. Hücreler daha sonra c-Jun ifadesinde hücre yayılımı ve alan rolünü keşfetmek için rhodamine-phalloidin ile boyandı.
Hücre kültürü alt tabakalarında hücre yapışkan çizgileri oluşturulduğunda, desen alt tabakasında tohumlanan hücrelerin nükleer en boy oranı, desensiz substratlar üzerindeki hücrelere kıyasla artmıştır. Hem c-Jun hem de p75 nörotrofin reseptörünün ekspresyonu daha küçük yayılma alanına sahip yoğun hücrelerde düzenlendi. Çizgi desenli hücreler de desensiz hücrelere kıyasla hem c-Jun hem de p75 NTR'nin daha yüksek bir ekspresyonu ile sonuçlandı.
Hücre yayılma alanını ve uzamasını tam olarak kontrol etmek ve hücre etkileşimlerini ortadan kaldırmak için mikrotemas baskılı hücre yapıştırıcı geometrileri oluşturuldu. Hücresel enboy oranının artırılması nükleer uzamanın artmasına neden oldu. C-Jun ekspresyonu hem hücresel uzama hem de hücre yayılma inhibisyonu ile düzenlendi.
Hem çekirdekler hem de aktin için immünoresans boyama, hücre yayılma alanı ve uzaması bu mikro desenleme yöntemi ile tam olarak kontrol edildiğini doğruladı. Bu teknik, schwann hücre biyolojisini ve sinyalizasyonu rejenerasyon ve kanser bağlamında mekanik olarak analiz etmek için bir yöntem olarak tunable substratlarımızı kullanmanın bir yolunu açmıştır.
