La purificación de la afinidad MS2 acoplada con la secuenciación del ARN o los MAPAS se ha desarrollado para identificar el targetome entero de cualquier ARN de interés en bacterias. Esta tecnología permite identificar cualquier tipo de socios de sRNA independientemente del mecanismo de regulación. La caracterización de las redes reguladoras dependientes del ARN ayudará a comprender mejor la producción de factores de virulencia, la formación de biopelículas y la supervivencia de las bacterias dentro de las células huésped y, en última instancia, a luchar contra las infecciones estafilocócicas.
Este protocolo se puede aplicar a cualquier bacteria grampositiva patógena o no patógena. Demostrando el procedimiento estará Noemie Mercier, una estudiante de doctorado del laboratorio del Dr.Pascal Romby. Para comenzar, crezca una colonia de cepas portadoras de plásmidos pCN51 P3 MS2 sRNA o pCN51 P3 MS2 en tres mililitros de medio BHI suplementados con 10 microgramos por microlitro eritromicina en duplicados.
Diluir cada cultivo nocturno en 50 mililitros de medio BHI fresco suplementado con eritromicina para alcanzar un OD 600 de 0,05. Cultivar los cultivos a 37 grados Centígrados con agitación a 180 RPM durante seis horas. Transfiera cada cultivo a un tubo centrífuga de 50 mililitros y centrífuga los tubos a 2, 900 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, luego deseche el sobrenadante, congele y guárdelos a menos 80 grados Celsius o mantenga los pellets en el hielo y realice directamente la lisis mecánica de las células.
Para realizar la lisis celular mecánica, resuspend pellets en cinco mililitros de tampón A y transferir las células resuspended a 15 tubos de centrífuga mililitros con 3,5 gramos de perlas de sílice. Inserte los tubos en un instrumento mecánico de lisis celular y ejecute un ciclo de 40 segundos a cuatro metros por segundo. Centrifugar los tubos a 2, 900 veces G durante 15 minutos, luego recuperar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.
Asegúrese de que el sobrenadante esté claro, repitiendo la centrifugación si no lo está. Retire la punta de la columna, luego coloque una columna de cromatografía en un estante de columna y lave la columna con agua ultrapura. Añadir 300 microlitros de resina de amilosa y lavar la columna con 10 mililitros de tampón A.Diluir 1, 200 picamoles de proteína MBP-MS2 en seis mililitros de tampón A y cargarlo en la columna.
Lave la columna con 10 mililitros de tampón A.Next, realice la purificación de afinidad MS2. Cargue el lysate de la célula en la columna y recoja la fracción del flujo-a través en un tubo limpio de la colección. Lave la columna tres veces con 10 mililitros de tampón A y recoja la fracción de lavado, luego eluda la columna con un mililitro de tampón E y recoja la fracción de elución en un microtubo de dos mililitros.
Mantenga todas las fracciones recolectadas en hielo hasta la extracción de ARN. Utilice un mililitro de cada fracción para la extracción de ARN. Agregue un volumen de fenol al ARN y mezcle vigorosamente, luego centrifugue la mezcla a 16, 000 veces G durante 10 minutos a 20 grados Celsius.
Transfiera la fase superior a un microtubo limpio de dos mililitros. Agregue un volumen de alcohol isoamilo de cloroformo y repita la centrifugación, luego transfiera la fase superior a un nuevo tubo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% frío y 0,1 volúmenes de tres molares de acetato de sodio a pH 5,2 y precipitar durante la noche a menos 20 grados centígrados.
Al día siguiente, centrífuga los tubos durante 15 minutos a 16,000 veces G y cuatro grados Centígrados. Retire lentamente el etanol con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Añadir 500 microlitros de etanol frío al 80% y centrífuga durante cinco minutos.
Deseche el etanol pipeteándolo lentamente, luego seque el pellet usando un concentrador de vacío durante cinco minutos en modo de carrera. Resuspend el pellet en un volumen apropiado de agua ultrapura. Este protocolo fue utilizado para estudiar el targetome de RsaC en S.aureus.
Varios ARNm que interactúan directamente con RsaC se identificaron utilizando la tecnología MAPS, revelando su papel crucial en el estrés oxidativo y las respuestas relacionadas con el metal. Para confirmar las construcciones del sRNA MS2 y visualizar su patrón de la expresión, las células fueron cosechadas después de dos, cuatro, y seis horas de crecimiento en medio de BHI. El ARN fue extraído y el análisis norteño de la mancha blanca /negra fue realizado usando la punta de prueba RsaC-específica del DIG.
El nivel de RsaC endógeno aumentó perceptiblemente después de seis horas de crecimiento. Es importante destacar que el nivel de MS2-RsaC 544 y MS2-RsaC 1, 116 fueron comparables a RsaC endógeno a las seis horas. La purificación de la afinidad fue realizada y los RNAs fueron extraídos del extracto crudo, del flujo-a través, y de las fracciones de la elución en la tensión del salvaje-tipo que expresaba la etiqueta MS2 solamente y la tensión mutante de RsaC que expresaba la construcción de MS2-RsaC 544.
El RsaC endógeno de 1,116 nucleótidos largos se enriqueció en la fracción de elución, pero interactuó no específicamente con la columna de afinidad debido a su longitud y estructura secundaria compleja. El MS2-RsaC 544 fue enriquecido altamente en la fracción de elución demostrando que fue retenido con éxito por la proteína de fusión MS2-MBP. Un análisis bioinformático reveló blancos supuestas del mRNA según el cambio del doblez entre el sRNA MS2 y el control MS2, indicando que el sodA era la primera blanco supuesta.
Un análisis norteño de la mancha blanca /negra realizó la punta de prueba sodA-específica del DIG después de la purificación de MS2-affinity muestra que el sodA co-enriquecido eficientemente con MS2-RsaC 544 comparado al control MS2. Al intentar este protocolo, tenga presente que la adición de la etiqueta MS2 puede afectar a la confirmación, estabilidad, o función del sRNA. Esto debe ser monitoreado cuidadosamente.
MAPS proporciona una instantánea del emparejamiento de objetivos de ARN-ARN. La validación experimental adicional desentrañará su función. Esta técnica representa una herramienta poderosa para construir redes reguladoras de sRNA en cualquier bacteria.
