Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (1 R01 GM095384-01) otorgado a Bosque Rohwer. Agradecemos Epicentro, una compañía de Illumina para proporcionar un acceso temprano a kits Ribo-Zero Epidemiología. Damos las gracias a Marcos Hatay para el diseño y producción de el soporte del tubo de ultracentrifugación. Damos las gracias a Andreas Haas y Benjamin Knowles para lecturas críticas y discusiones del manuscrito, y Lauren Paul para ayudar al proceso de filmación.

The authors have nothing to disclose.

La metagenómica viral Las partículas virales se concentraron usando polietilenglicol (PEG) precipitación o pequeños concentradores de volumen. En algunos casos, puede no ser necesario concentración, pero antes de la filtración o centrifugación a baja velocidad pasos se utilizan para eliminar las células eucariotas y microbianos. Lisados ​​virales se enriquecerán aún más y se purificaron usando la densidad de ultracentrifugación en gradiente de 9,41 o filtros de pequeño tamaño (por ejemplo, 0,45 m) para eliminar las células microbianas eucariotas y grandes 25. Ultracentrifugación en gradiente de densidad se lleva a cabo típicamente con soluciones densas pero inertes, tales como sacarosa o cloruro de cesio para aislar y concentrar partículas virales 41. La separación física se basa en el tamaño y la densidad de flotación de las partículas virales. Por lo tanto, la elección apropiada del tamaño de poro del filtro y la preparación rigurosa de los gradientes son esenciales para aislar a las comunidades específicas virales, como el éxito de la recuperación física deVLP determina la comunidad aislado 41 (es decir, partículas virales que no pasan a través del filtro o caen dentro de la densidad de la extracción no serán detectados en el metagenoma). Después del aislamiento viral y la concentración, puede haber contaminación de material genómico no viral presente en la muestra tanto en la forma de ácidos nucleicos libres y microbiana y las células eucariotas. Por lo tanto, es crítico para verificar la pureza de las partículas virales en muestras (Figuras 1A y 1B). Un tratamiento de cloroformo se utiliza comúnmente para lisar las células restantes, seguido por tratamiento con nucleasa para degradar ácidos nucleicos libres antes de la extracción de ácido nucleico. Una advertencia al flujo de trabajo presentado fue el uso de la separación en gradiente de densidad para aislar partículas virales ya que puede excluir partículas virales con envuelta que pueden ser demasiado boyante para entrar en el gradiente de CsCl. Una alternativa &quot;-catch-all&quot; método es omitir la SEPAR gradiente de densidadación y aislar el ADN de la comunidad a partir de los 0,45 m - filtrados tratados con cloroformo y DNasa I. Este método también es adecuado para dar cabida a pequeños volúmenes de muestra, como los de hisopos o plasma sanguíneo. Sin embargo, esto puede resultar en la contaminación bacteriana cloroformo-resistente y una mayor cantidad de ADN extracelular DNasa I-resistente. Protocolos de secuenciación actuales requieren de 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN mediante el cual los rendimientos más altos proporcionan una mayor variedad de opciones de secuenciación. La concentración de ADN de viromes generados a menudo va desde debajo del límite de detección a más de 200 ng / l. La cantidad de ácidos nucleicos virales recuperadas puede ser insuficiente para la preparación de biblioteca de secuenciación directa. En tales casos, la amplificación de ácido nucleico es esencial. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) 2,42,43 y amplificación del genoma basado en múltiples desplazamientos de amplificación (MDA) son los doslos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. MDA métodos tales como los basados ​​en ADN polimerasa Phi29 se sabe que sufren de sesgos de amplificación, y pueden amplificar preferentemente ssDNA y DNA circular, lo que resulta en taxonómica no cuantitativo y caracterización funcional 44,45. Una versión optimizada del enfoque LASLs se ha demostrado que sólo introducir sesgos mínimos, promueve una mayor sensibilidad (para pequeñas cantidades de material de partida), y se adapta fácilmente para diferentes plataformas de secuenciación 43. Sin embargo, el enfoque tiene muchos pasos, requiere un equipo especializado para minimizar la pérdida de ADN, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. En nuestro laboratorio, este enfoque se ha adaptado con éxito para amplificar cantidad detectable e indetectable de ADN extraído de lavage- broncoalveolar, VLP derivadas de agua coral- y marinos (no publicados y Hurwitz et al. 46). El desarrollo de las tuberías de análisis de datos tiene classically sido uno de los aspectos más desafiantes de análisis de metagenómica viral debido a la naturaleza muy diversa y en gran parte desconocida de las comunidades virales. Si bien se estima que hay 10 8 genotipos virales en la biosfera, bases de datos actualizadas virales actuales contener ~ 4.000 genomas virales, que es aproximadamente 1 / número 100.000 de esta diversidad viral totales aproximados. Por lo tanto, búsquedas basadas en similitud (tales como BLAST 47) para la asignación taxonómica y funcional en metagenomes virales poseen desafíos inherentes. Muchas secuencias de dejar de tener importantes similitudes con genomas en la base de datos y, por tanto, se clasifican como desconocido. A pesar de que las búsquedas basadas en homología son las aplicaciones más importantes para la asignación de la taxonomía y la función de secuencia de datos, enfoques alternativos basados ​​en el análisis de bases de datos independientes se han desarrollado 48- 50. Fancello et al. 51 proporcionan una revisión completa de herramientas computacionales y algoritmos utilizados en Viral metagenómica. Microbiana metagenómica Típicamente, la cantidad total de ADN extraído de las comunidades hipotónicas lisis tratados microbianos (ADN-HL) van de 20 ng a 5 mg. El rendimiento depende en gran medida del estado de salud del paciente y la cantidad de muestra de esputo recogidos, que explica las variaciones observadas en el rendimiento total de HL-ADN extraído en este estudio (Tabla 2). Los pasos críticos para generar datos de la secuencia de buena calidad dependen de la calidad de las bibliotecas de secuenciación generados. La Figura 2 muestra un intervalo de tamaño típico para las bibliotecas de secuenciación generados a partir de ADN microbiano derivado de esputo CF utilizando un procedimiento de fragmentación de ADN basado en enzimática. El tamaño óptimo de la biblioteca depende de la elección de la plataforma de secuenciación y la aplicación, y por lo tanto, el procedimiento de fragmentación puede ser optimizado, si es necesario, a través de enfoques alternativos, tales como sonicación y la nebulización. Además delos resultados representativos presentados, el éxito del método presentado en el esputo CF recogida en múltiples pacientes a través de múltiples puntos de tiempo también se ilustra en Lim et al. (2012) 9 y Lim et al. (2014) 10. Estudios previos 9,10 sugieren que cada paciente alberga un conjunto único de la comunidad microbiana que cambia con el tiempo, lo cual refleja la persistencia de los principales actores de la comunidad, mientras que las fluctuaciones son probablemente debido a perturbaciones tales como los tratamientos con antibióticos. Ya sea que estas fluctuaciones se producen a diario, incluso sin perturbaciones externas o por procedimiento de muestreo y procesamiento de la muestra, se encuentra todavía en cuestión. Basado en el metagenomic-DNA HL y análisis amplicón 16S rDNA, la toma de muestras longitudinal 7-días muestra que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico (Día 1, 2, y 3) fue mínima (Figuras 3A y 3B). Tras la introla producción de antibióticos orales inmediatamente después de la toma de muestras Día 3, los cambios en el perfil de la comunidad se hicieron evidentes en el Día 4. Mientras que el antibiótico ciprofloxacino se dirige a un amplio espectro de patógenos bacterianos conocidos tales como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus y la neumonía, el tratamiento aumentó la abundancia relativa de P. aeruginosa, mientras que la disminución de la Streptococcus spp. y P. melaninogenica. Para el día 6, la comunidad se recuperó lentamente a la estructura inicial de la comunidad de partida. Los resultados sugieren que las fluctuaciones de los perfiles microbianos dentro de un solo paciente es más probable debido a las perturbaciones de la comunidad en las vías respiratorias. Dada la coherencia entre los perfiles microbianos de las bibliotecas y metagenomes 16S ADNr de ADN derivado de HL, descartamos los sesgos procedentes de los cebadores de 16S rRNA utilizadas en este estudio. Una posible explicación para las diferencias observadas a través de 16S rDNA taxonómicoAL perfiles generados a partir de ADN total y el ADN derivado de HL (Figura 3B) puede ser la presencia de altas cantidades de Pseudomonas spp. ADN extracelular después del tratamiento antibiótico. Esto es apoyado por los hallazgos de que estas diferencias fueron más evidentes en el día 7, tres días después del tratamiento de antibióticos, que se enfoca en Pseudomonas spp. además de otros. El ciprofloxacino se utiliza comúnmente como el tratamiento de primera línea en pacientes con FQ y P. crónica infección aeruginosa aunque su espectro de actividad incluye la mayoría de los patógenos CF-asociado. La hipótesis de que el tratamiento antibiótico erradica comunidades susceptibles incluyendo Streptococcus spp. y por lo tanto la creación de un nicho de llenado por resistentes P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa puede ganar resistencia a través del aumento de sus comunidades de biopelícula y el ADN extracelular se ha demostrado para ser el principal soporte estructural de su arquitectura biofilm 52. A pesar de que tque la estructura comunitaria se recuperó, el ADN extracelular puede haber permanecido en el esputo CF. Por lo tanto, estos datos sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado que se presentan en este flujo de trabajo potencialmente beneficiarse en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, pero el ADN extracelular derivado también microbiana-que pueden falsear los perfiles microbianos reales. Metatranscriptomics Una alta calidad metatranscriptome debe contener relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (rRNA) y representan un muestreo imparcial de las transcripciones de la comunidad (ARNm). Debido a la corta vida media y la cantidad limitada de mRNA, es crítico que el protocolo, tal como se presenta aquí, minimiza la manipulación de la muestra para maximizar el número de transcripciones recuperados. En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. Estos incluyen Microb Enrich, Ribo-Zero, y muestra específica h sustractivoybridizations 53 que se basan en la hibridación de oligonucleótidos, y el ARNm-ONLY kit que se basa en ARN centrarse en la actividad enzimática que contiene una exonucleasa &#39;monofosfato 5. Además, varios enfoques para enriquecimientos de ARNm tales como el Kit II-bacterias MessageAmp que preferentemente polyadenylates y amplifica ARN lineal están también disponibles. Algunos de estos métodos (por ejemplo, ARNm-ONLY, Microb E xpress y la MessageAmp) se utilizan simultáneamente para una eficiencia óptima. Sin embargo, la eficacia de todos estos enfoques es limitado, especialmente cuando se trabaja con rRNA parcialmente degradada, como a menudo observado en el ARN total extraído de muestras de CF. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar para generar metatranscriptomes que consisten tanto en ARNm eucariota y procariota. Además, el poli (A) de cola añaden a las secuencias pueden reduce la cantidad de datos de secuencias útiles. Las regiones con tramos de homopolímero tenderán a tener puntuaciones más bajas de calidad, causing un importante número de lecturas que ser filtrados por secuenciación y software de post-secuenciación, y la duración media de lectura útil tras el recorte de colas de poli (A) se reducirán significativamente 54. Tratar con las comunidades microbianas CF complejas y ARN parcialmente degradado (Figuras 4A y 4C), nuestro estudio anterior mostró que el método de hibridación de captura por el kit de oro Ribo-Zero fue más eficaz en la eliminación de ambos rRNA humana y microbiana en comparación con los tratamientos combinan utilizando otros kits 9 (Tabla 3). Los datos resultantes permite el análisis simultáneo de ambos huésped humano y transcripciones microbianas. Dependiendo del rendimiento y calidad de RNA, así como la elección final de la plataforma de secuenciación, muchos de estos procesos, incluyendo la etapa de síntesis de ADNc, pueden simplificarse con la generación de bibliotecas de secuenciación. Por ejemplo, el ARN tratado Ribo-Zero puede ser utilizado para hacer libra secuenciación metatranscriptomeRies usando el kit de ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparación. Análisis de metagenómica de comunidades asociadas a animales proporciona una representación completa de la entidad funcional global que incluye la acogida y sus comunidades asociadas. El flujo de trabajo que aquí se presenta es adaptable a una variedad de muestras asociadas con animales complejos, especialmente aquellos que contienen moco espeso, altas cantidades de restos de células, el ADN extracelular, proteínas y complejos de glicoproteína, así como células huésped, además de la microbiana y viral deseado partículas. A pesar de que las partículas virales y microbianas se pueden perder en cada paso, las partículas de aislamiento y purificación son esenciales para minimizar la cantidad de ADN del huésped. Si bien los datos metagenómica ofrece potenciales metabólicas de las comunidades examinados, metatranscriptomics complementar este revelando la expresión diferencial de funciones codificadas 9. Una evaluación integral de los datos de genómica y transcripciones ha producido nuevas insERECHOS a la dinámica de las interacciones de la comunidad y facilita el desarrollo de la mejora de las terapias 9,10,55.

<html> Comunidades virales y microbianos asociados con el cuerpo humano se han investigado ampliamente en la última década a través de la aplicación de tecnologías de secuenciación de 1,2. Los resultados han llevado al reconocimiento de los microbios importancia en la salud humana y la enfermedad. La principal iniciativa provino del proyecto humano microbioma que describe las bacterias (y algunas arqueas) que reside en la piel humana, y dentro de las cavidades orales, vías respiratorias, tracto urogenital y el tracto gastrointestinal 3. Otros estudios microbioma de las vías respiratorias sanas humanos a través de lavado broncoalveolar (BAL) 4,5 y frotis nasofaríngeos 4 han demostrado que el pulmón puede servir como un dispositivo de muestreo ambiental, resulta en la colonización microbiana transitoria en las vías respiratorias. Sin embargo, el impacto de la colonización microbiana en las superficies de las vías respiratorias con discapacidad puede conducir a infecciones pulmonares graves y crónicas, como las que se observan en la fibrosis quística (FQ) de los pacientes. t &quot;&gt; CF es una enfermedad genética mortal causada por la mutación en la fibrosis quística transmembrana regulador (CFTR) gen 6. Estas mutaciones dan lugar a proteínas CFTR defectuosos que a su vez afectan al transporte transepitelial de iones a través de la superficie apical del epitelio. La enfermedad afecta múltiples sistemas de órganos, pero la mayoría de la mortalidad y la morbilidad es atribuible a la enfermedad pulmonar de la FQ 7. El CF pulmón proporciona un ecosistema único para la colonización microbiana. El defecto en el transporte de iones hace que el moco se acumula en las vías respiratorias CF, creando microambientes que constan de aeróbica , microaerófilas, y los compartimentos anaeróbicos anclado por una superficie mucosa rica en nutrientes estática. Este entorno facilita la colonización y proliferación de microbios, incluyendo virales, bacterias y hongos. agudas y las infecciones microbianas pulmonares crónicas conducen a respuestas inmunes constantes pero ineficaz, dando como resultado amplia remodelación de las vías respiratorias, pérdida de la capacidad pulmonar, y en última instancia pulmofracaso nario. Las comunidades bacterianas asociadas con el pulmón con FQ han sido bien descritos usando ambos enfoques cultura-dependientes e independientes del cultivo, que incluyen el uso de 16S ARN ribosomal (ARNr) de secuenciación de genes 8 y metagenómica escopeta 9,10. El enfoque basado en el rRNA 16S es capaz de caracterizar una amplia gama de especies microbianas y capturar grandes cambios en la diversidad de la comunidad. Sin embargo, está limitado en su resolución en la definición de las comunidades (resumidos en Claesson et al. 2010 11) y las predicciones de los potenciales metabólicos se limitan a aquellas funciones generales conocidos para la taxones identificados. Por lo tanto, los métodos de secuenciación del gen 16S rRNA son insuficientes para la taxonómica y funcional precisión analítica necesaria de las diversas comunidades microbianas presentes en los pulmones con FQ. El enfoque descrito aquí metagenomic complementa el enfoque basado en el rRNA 16S, supera sus limitaciones, y permite una manera relativamente eficazpara analizar tanto la taxonomía comunidad microbiana y contenidos genéticos en los pulmones con FQ. ADN microbiano aislado de muestras asociadas con animales a menudo contiene una gran cantidad de ADN del huésped. Muestras de esputo o tejido pulmonar CF generalmente contienen una gran cantidad de ADN humano liberado por los neutrófilos en la respuesta inmune, a menudo mayor que 99% del ADN total de 12 - 14. Aunque algunas células humanas intactas pueden estar presentes, la mayoría de este ADN es libre en solución o adsorbido a la superficie de los microbios. Además, la presencia de tapones de moco excepcionalmente viscosos, restos celulares y otros contaminantes desconocidos complicar aún más el aislamiento de las células microbianas. Varios métodos se ensayaron para determinar ozono estas muestras de ADN humano, incluyendo gradientes de Percoll a humano separado a partir de células microbianas 15, el tratamiento con DNasa I, monoazida de bromuro de etidio para degradar selectivamente el ADN humano 16, y el kit de MolYsis, todos con éxito limitado.<html> Hasta la fecha, el procedimiento de purificación de ADN microbiano más eficaz para esputo CF ha sido una modificación del procedimiento descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Este enfoque, en este documento conocido como método de lisis hipotónica (HL), utiliza una combinación de β-mercaptoetanol para reducir los enlaces disulfuro de mucina, lisis hipotónica de las células eucariotas, y tratamiento con DNasa I de ADN soluble 9. A pesar de la falta de alternativas al método HL planteó algunas preocupaciones debido a (i) los posibles sesgos resultantes de la lisis no deseado de los microbios y (ii) si las fluctuaciones observadas en la composición de la comunidad 9,10 son un artefacto de variaciones asociadas con el procesamiento de la muestra. Además de la generación de metagenomes de escopeta, que abordar estas cuestiones mediante la comparación de los perfiles de genes 16S rRNA del ADN total y el ADN microbiano extraído de la HL método utilizando el mismo conjunto de muestras de esputo recogidas de un solo paciente a través de siete días consecutivos. ent &quot;&gt; En comparación con las comunidades microbianas, la caracterización de las comunidades virales asociados con los animales es limitada 18,19 Las comunidades virales en las vías respiratorias CF sólo se han caracterizado mínimamente 20 -.. 22 El primer estudio metagenomic caracterizar el ADN de las comunidades virales en CF vías respiratorias mostraron que la mayoría de los virus asociados con los pulmones con FQ son fagos 20. El potencial metabólico del fago en CF y CF individuos no fue significativamente diferente. Específicamente, las comunidades de fagos en individuos CF llevan genes reflectante de adaptaciones huésped bacterianas a la fisiología de las vías respiratorias CF, y la virulencia. 20 estudios de metagenómica posteriores bacterianas de los virus en el tejido pulmonar de la FQ demostraron heterogeneidad espacial distinta de las comunidades virales entre las regiones anatómicas 22. Además, el tejido pulmonar de la FQ albergaba la diversidad viral más bajo observado hasta la fecha en cualquier ecosistema 22. La mayoría de los virus identificados eran fagoscon el potencial de infectar a los patógenos de FQ. Sin embargo, también se detectaron virus eucariotas tales como herpesvirus, adenovirus, y virus del papiloma humano (VPH). En un caso, cuando se observaron quistes en el tejido pulmonar durante la disección, se recuperó más de 99% de un genoma de virus del papiloma humano, a pesar de que el paciente nunca fue diagnosticado con un papiloma o carcinoma pulmonar. Esto indica que la diversidad viral presente no sólo refleja la gravedad del daño tisular, pero también puede exponer y explicar una enfermedad subyacente no caracterizado. Los protocolos descritos aquí proporcionan una manera simple, pero potente para aislar partículas virales (VLP) a partir de muestras que consisten en grandes cantidades de moco espeso, el huésped y células microbianas, ADN libre, así como los restos celulares. Como complemento de la metagenómica, metatranscriptomics se utiliza para controlar la dinámica en la expresión génica a través de la comunidad microbiana y el anfitrión 9,23. En este caso, tanto microbiana y host mRNA necesita ser seleccionado preferentemente. Desde mRNAs bacterianas no se polyadenylated, un método desplegable mRNA a base de oligo-dT no puede ser explotada. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar en muestras de acogida asociada si se conocen las muestras para contener grandes cantidades de ARNm eucariota. Muchas muestras asociadas a animales, incluyendo el esputo CF, contienen una alta densidad de células, además de altas cantidades de desechos celulares y nucleasas que incluyen RNasas. Por lo tanto, otro reto es evitar una degradación del ARN durante metatranscriptome procesamiento. En la mayoría de los casos, el ARN total extraído de esputo de FQ es parcialmente degradada, lo que limita las aplicaciones posteriores y utilidad de los ARN derivado. En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. La eficacia de estos enfoques se limita, sin embargo, especialmente cuando se trabaja con parcialmente degradado rRNA 9,24. Los métodos empleados aquí permitened para la recuperación de ARN total parcialmente degradado apropiado para la eliminación total de rRNA aguas abajo eficiente. La comparación directa de la eficiencia en la eliminación de rRNA partir de ARN total parcialmente degradado comparar dos kits diferentes fue ilustrado por Lim et al. (2012) 9. En general, el objetivo de este manuscrito es proporcionar un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar metagenomes escopeta virales y microbianas, y un metatranscriptome, a partir de una sola muestra asociada al animal, utilizando muestras de esputo inducido como un ejemplo. Molecular flujo de trabajo de laboratorio debe incluir áreas de pre y post-amplificación separadas para minimizar la contaminación cruzada. Los métodos son fácilmente adaptables a otros tipos de muestras tales como el tejido 22, nasofaríngeo y orofaríngeas 25, lavado broncoalveolar (BAL) y coral (datos no publicados). Cada muestra debe procesarse inmediatamente después de la recolección, especialmente cuando la metagenómica microbianos y se reunióse desean estudios atranscriptomics. Si se congelaron las muestras, limita el aislamiento de células microbianas intactas para metagenomes microbianas como la congelación potencialmente alterar la integridad celular. Sin embargo, la congelación no excluye metatranscriptomics y aislamiento viral, pero la calidad del ARN y la cantidad de partículas virales recuperados pueden verse afectados por el proceso de congelación y descongelación. Es importante señalar que el esputo inducido ha servido como la fuente primaria de muestras en muchos estudios asociados con los pacientes adultos con FQ y otras enfermedades pulmonares crónicas como 26,27 BAL puede ser demasiado invasiva. En nuestros estudios, las muestras de esputo fueron recogidos con un método de muestreo cuidadoso y consistente, es decir, tras el enjuague bucal y el enjuague de la cavidad bucal usando solución salina estéril para mantener los microbios orales contaminación dentro de las muestras de esputo a un mínimo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

La accesibilidad de secuenciación de alto rendimiento ha revolucionado muchos campos de la biología. A fin de comprender mejor a las comunidades microbianas y virales de acogida asociada, se desarrolló un flujo de trabajo integral para la extracción de ADN y ARN. El flujo de trabajo genera simultáneamente metagenomes virales y microbianos, así como metatranscriptomes, desde una sola muestra para la secuenciación de próxima generación. El acoplamiento de estos enfoques ofrece una visión general de las características tanto taxonómicas y las funciones de la comunidad codificado. Los métodos presentados utilizan fibrosis quística (CF) de esputo, un tipo de muestra problemático, porque es excepcionalmente viscosa y contiene alta cantidad de mucinas, el ADN de neutrófilos libre, y otros contaminantes desconocidos. Los protocolos descritos aquí se dirigen a estos problemas y con éxito recuperar ADN viral y microbiano con la contaminación de ADN humana mínima. Para complementar los estudios de metagenómica, un protocolo metatranscriptomics se optimizó para recuperar tanto microbianay ARNm host que contiene relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (ARNr). Una visión general de las características de los datos se presenta a servir de referencia para evaluar el éxito de los métodos. Adicional muestras de esputo CF también se recogieron a (i) evaluar la consistencia de los perfiles microbioma en siete días consecutivos dentro de un mismo paciente, y (ii) comparar la coherencia del enfoque metagenómica a una basada en la secuencia del gen 16S ARN ribosomal. Los resultados mostraron que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico fue mínima y los perfiles de taxonomía de las bacterias asociadas-CF comunes eran muy similares entre las bibliotecas de 16S rDNA y metagenomes generados a partir del ADN -derivado lisis hipotónica (HL). Sin embargo, las diferencias entre los perfiles taxonómicos 16S rDNA generan a partir de ADN total y el ADN derivado de HL sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado se benefician en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, sino también extracellul derivados de microbiosADN ar que pueden falsear los perfiles microbianos reales.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K vistas.  San Diego State University.  Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purificación del ADN plásmido de las colonias de bacterias Utilizando el kit de Qiagen Miniprep

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Investigación

Biología

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

La disección bruto del estómago de la langosta, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Análisis de metagenómica cuasi de Salmonella de muestras alimentarias y ambientales

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.