Este protocolo permite manipular proteínas, o expresión de microARN, en adipocitos diferenciados para estudiar su papel en la función de los adipocitos. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos en adipocitos 3T3-L1 de ratón. Este método también se puede aplicar a preadipocitos humanos diferenciados en adipocitos.
Demostrando el procedimiento estará Melanie Gaudfrin, una técnica de nuestro laboratorio. Cultive los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 milímetros en DMEM sin piruvato, glucosa 25 milimolar, suero de ternero recién nacido al 10% y uno por ciento de penicilina y estreptomicina. Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y siete por ciento de dióxido de carbono.
Dos días después de la confluencia, cambie el medio de cultivo, reemplazándolo con DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina suplementadas con 0.25 milimolares IBMX, 0.25 micromolares dexametasona, cinco microgramos por mililitro de insulina y 10 rosiglitazona micromolar. Incubar los platos durante dos días. Dos días después, reemplace el medio de cultivo con DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina suplementados con cinco microgramos por mililitro de insulina y 10 rosiglitazona micromolar e incube durante otros dos días.
Alimente las células cada dos días con DMEM sin piruvato, glucosa 25 milimolares, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina y mantenga las células en la incubadora. Un día o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 microgramos por mililitro en etanol al 30% a partir de una solución de stock a un miligramo por mililitro. Agregue 250 microlitros de colágeno por pozo de una placa de 12 pozos o 125 microlitros por pozo de una placa de 24 pozos y extienda la solución sobre la superficie del pozo.
Deje la placa sin la tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Luego lávelo dos veces con D-PBS. Pipetear el siRNA con un medio esencial mínimo mejorado para mezclar e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Agregue el reactivo de transfección y el medio esencial mínimo mejorado al siRNA y la pipeta para mezclar. Incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego agregue la mezcla de transfección a cada pozo de la placa recubierta de colágeno.
Lave las células en la placa de Petri de 100 milímetros dos veces con D-PBS. Agregue 5x tripsina a las células, asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 segundos y retire cuidadosamente la tripsina.
Incubar la placa de Petri durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora. Luego toque el plato para separar las células, evitando el daño celular. Agregue 10 mililitros de DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina.
Pipetee cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular. Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Malassez o un contador celular automatizado y ajuste la concentración de las células a 0,625 millones de células por mililitro de medio. Sece 800 microlitros de la suspensión celular por pozo de una placa de 12 pozos o 400 microlitros de la suspensión celular por pozo de una placa de 24 pozos que contiene la mezcla de transfección.
Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular y no molestarlas durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, glucosa 25 milimolar, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina y devuelva las células a la incubadora. Los puntos de tiempo típicos para detectar el derribo objetivo después de la administración de siRNA o miR son de 24 a 48 horas para el ARNm y de 48 a 96 horas para la proteína.
Se pueden realizar experimentos funcionales en adipocitos transfectados, incluida la señalización de insulina, la absorción de glucosa, la secreción de adipoquinas, la lipólisis y la lipogénesis. Se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección. Dos días después de la transfección, los adipocitos presentaron gotas lipídicas multiloculares con contenido lipídico no diferente entre los adipocitos transfectados y no transfectados.
La expresión de ARNm de varios marcadores de diferenciación no se modificó en las células transfectadas en comparación con la de los adipocitos no transfectados. El protocolo de transfección inversa es eficiente ya que más del 70% de los adipocitos fueron transfectados. Tres días después de la transfección con siRNA contra Perilipina-1, el nivel de ARNm de Perilipina-1 había disminuido en un 70% y el nivel de proteína en un 63%La expresión de Perilipina-1 también se analizó por microscopía de fluorescencia cuatro días después de la transfección y se encontró que había disminuido en un 92% en comparación con su expresión en adipocitos de control.
La transfección inversa de adipocitos con microARN que imita a los oligonucleótidos para regular al pie la expresión de miR-34a se muestra aquí. La sobreexpresión de miR-34a condujo a la disminución de la expresión de la proteína VAMP2 en un 50%El derribo de la perilipina-1 en los adipocitos 3T3-L1 condujo a un aumento de la lipólisis basal, mientras que la sobreexpresión de miR-34a condujo a la inhibición de la fosforilación de la proteína quinasa B inducida por la insulina y la absorción de glucosa. Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación de adipocitos para realizar la transfección en adipocitos recién diferenciados y controlar cuidadosamente el tratamiento de los adipocitos con tripsina.
Después de la transfección, es posible realizar experimentos funcionales en los adipocitos para estudiar el impacto de las proteínas o la manipulación de microARN en la señalización de la insulina, la absorción de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis.
