The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

Los ratones fueron criados y tratados de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio del Comité de Bienestar Animal de la Universidad. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por este Comité. 1. Revestimiento de la microscopía de plástico cámaras de cultivo NOTA: Realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los dos tipos de recubrimiento son funcionalmente equivalentes. <ol><li> Cámaras de cultivo de plástico Escudo con fibronectina un día antes del aislamiento de los tejidos de la tiroides: <ol><li> Diluir fibronectina estéril a una concentración final 50 mg / ml en medio M199 suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,25 mg / ml de fungizona y 2 mM de glutamina 12. </li><li> Cubrir los pocillos con 200 l de fibronectina se diluye y se incuba durante la noche en un refrigerador a 4 °. </li><li> En el día de la disección, aspirar la fibronectina, enjuagar los pocillos una vez con M199 y añadir un volumen mínimo de 200 l de M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal. </li><li> Deje las cámaras revestidas en la incubadora hasta que esté listo a la placa de los explantes. </li></ol></li><li> Escudo de plástico cámaras de cultivo con colágeno tipo I de 2 horas antes del aislamiento de los tejidos de la tiroides: <ol><li> Diluir tipo I colágeno estéril a una concentración final 50 mg / ml en HCl 10 mM. NOTA: Mantenga colágeno solución madre en hielo. </li><li> Cubrir los pocillos con 200 l de tipo I colágeno diluida y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). </li><li> Aspirar la solución de colágeno de tipo I, enjuagar los pocillos una vez con M199 y añadir un volumen mínimo de 200 l de M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal. </li><li> Deje las cámaras revestidas en la incubadora hasta que esté listo a la placa de los explantes. </li></ol></li></ol> 2. Disección de la tiroides Anlagen contienen tejidos (E12.5) o de la tiroides Lóbulos (E13.5-e14.5) NOTA: Utilice las herramientas de disección limpias y placas Petri / cultura. Los pasos generales y las incisiones se describen a continuación son los mismos para E12.5 y embriones E14.5. <ol><li> Sacrificio oportuna embarazada ratones hembra en la embrionaria deseada (e) días (a partir de E12.5 a E14.5) y extraer el útero utilizando instrumentos de disección. </li><li> Coloque el útero diseccionado en una placa de 10 cm que contiene HBSS. </li><li> Mantenga un extremo del útero con fórceps y abrir el útero con unas tijeras pequeñas para liberar progresivamente todos los embriones. </li><li> Separe los embriones de la placenta con unas tijeras y la transferencia de los embriones con sus membranas extraembryonic en una nueva placa de 10 cm que contiene HBSS. </li><li> Retire el saco vitelino y el amnios. NOTA: A partir de este punto, el trabajo bajo un microscopio estereoscópico con transiluminación de abajo; aumentando la ampliación con los pasos de disección. Use agujas de tungsteno en capilares de vidrio como herramientas de disección. </li><li> Uso de las agujas comoun cuchillo y un tenedor, retirar la parte superior de la cabeza, incluyendo la mandíbula superior y los oídos (Figura 1A, corte a lo largo de una). </li><li> Mantenga el embrión en su parte posterior y quitar primero una pieza extra del tubo neural (Figura 1A, corte a lo largo b), entonces la parte inferior del embrión, justo debajo de los miembros anteriores y por encima del corazón (Figura 1B). </li><li> Transferir la rebanada embrión que contiene la lengua (para orientar el tejido) y la región del cuello en una nueva placa de 10 cm que contenía HBSS. </li><li> Quitar el tubo neural y tejidos posterior al esófago / tráquea (Figura 1C, un corte a lo largo). </li><li> Suavemente la sección de la lámina de tejido a lo largo de ambos lados de la lengua (Figura 1C, cortado a lo largo de B y B &#39;). </li><li> Localice el esófago y la tráquea, en la prolongación de la lengua, y diseccionar la lengua, dejando el aritenoides hinchazón (Figura 1D, corte a lo largo de una), y el tejido de both lados del esófago / tráquea (Figura 1D, corte a lo largo b y b &#39;). </li><li> Retire el esófago, la tráquea y el lugar con el lado ventral hacia arriba. </li><li> Diseccionar los tejidos no deseados tales como el timo (Figura 1E) y todos los tejidos situados lateralmente a las arterias arco faríngeo. Para E13.5 o embriones E14.5, visualizar los lóbulos tiroideos en cada lado de la tráquea (Figura 1F; líneas de puntos rojos) y diseccionar los lóbulos de la tráquea. </li><li> Transferir el aislado región tráquea E12.5, o los lóbulos tiroideos E13.5-E14.5 en una placa de cultivo de 35 mm que contiene medio M199 pre-calentado suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal. Traslado explantes utilizando un filtro de boquilla prehumedecida sobre una micropipeta P-200. Para explantes E12.5, corte el extremo de la punta para ensanchar la abertura. NOTA: De forma rutinaria, y si los embriones tienen el mismo genotipo, realice los pasos 6 y 7 en todos los embriones, laN 9-11, y finalmente 12 y 13. </li></ol> 3. Plating y Cultura de la tiroides explantes <ol><li> Lavar los explantes por transferencia sucesiva en tres pocillos de una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de cultivo pre-calentado (= M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal). </li><li> Plating de lóbulos tiroideos sobre recubiertas de microscopía cámaras de cultivo de plástico: <ol><li> Aspirar M199 medio de cultivo de las cámaras revestidas. </li><li> Con cuidado, la transferencia de los explantes de tiroides en las cámaras de cultivo utilizando una micropipeta y puntas con filtro. Coloque un explante en el centro de cada cámara. </li><li> Retire el exceso de medios y coloque la cámara de cultivo en una incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO 2) durante 2 horas para permitir que los explantes se adhieren a la matriz. </li><li> Añadir suavemente 200 a 300 l de medio de cultivo pre-calentado a cada pocillo. </li><li> Incubar durante el cultivo a largo plazo en la incubadora de cultivo de tejidos. </li></ol></li><li> Plating of región tráquea o de la tiroides lóbulos en filtros semiporosas: <ol><li> Llene el número de pocillos de una placa de 24 pocillos requerido con 330 l de medio de cultivo pre-calentado. </li><li> Poner el filtro (por ejemplo, 0,4 micras filtro Millipore) en el medio, teniendo cuidado de evitar la captura de burbujas de aire por debajo del filtro de la cultura. </li><li> Con cuidado, utilizando una micropipeta y puntas con filtro en la transferencia de los explantes de tiroides con un volumen mínimo de medio sobre el centro de los filtros (máximo 4/filter). </li><li> Retire el exceso de medio y en el espacio los explantes con una aguja de tungsteno. </li><li> Incubar durante el cultivo a largo plazo en la incubadora de cultivo de tejidos. NOTA: El cambio de medio de cultivo cada dos días bajo la campana de flujo laminar. Cultura de los explantes de hasta 7 días. </li></ol></li></ol> 4. Todo el montaje Protocolo de tinción de inmunofluorescencia para la tiroides explantes Desalojar explantes cultivados en filtros (después del paso 2 abajo) el uso de agujas de tungsteno opinzas finas y la transferencia en una placa de 24 pocillos para todos los pasos, excepto el primario (paso 5) y secundaria (etapa 7) incubaciones de anticuerpos (placas de 96 pocillos). Para explantes adherentes cultivadas en cámaras de plástico de microscopía, realice todos los pasos en las cámaras de cultivo. <ol><li> Medio de cultivo Aspirar M199 y fijar el explante con helado paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min (500 l en el plato de 24 pozos y 300 l en microscopía diapositivas). </li><li> Lavar 2x 10 min en solución salina tamponada con Tris con Triton (TBST; 50 mM de Tris HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100) a TA. </li><li> Procesar los explantes inmediatamente o almacenar a -20 ° C. NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, se deshidratan los explantes en metanol al aumentar gradualmente la concentración de metanol en TBST para alcanzar el 100% de metanol. Cuando esté listo para continuar con la inmunotinción (paso 4), rehidratar los explantes añadiendo gradualmente TBST a metanol. </li><li> Reemplazar TBST con la solución de bloqueo (10% suero de cabra normal en TBST) E incubar en un agitador mar-sierra durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Diluir el anticuerpo primario en solución de bloqueo (100-200 l por condición). La transferencia de los explantes de &quot;filtrar&quot; a partir de una placa de 24 pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar explantes con los anticuerpos primarios en un rockero mar-sierra durante la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, desechar la solución de anticuerpo primario, la transferencia de los explantes de &quot;filtro&quot; de nuevo en una placa de 24 pocillos y lavar por lo menos cinco veces con TBST en un rockero mar-sierra durante 45-60 minutos en cada una a TA. </li><li> Diluir anticuerpo secundario (por ejemplo, cabra anti-X-Alexa Fluor a 1:2.000 dilución) en TBST que contenía 1% de suero normal de cabra y se incuban los explantes con esta dilución durante la noche en un eje de balancín mar-sierra a 4 ° C y en la oscuridad. Para la contratinción nuclear, se compone de 1 g / ml de bis-Benzimida (Hoechst) junto con la solución de anticuerpo secundario. </li><li> El día siguiente, desechar la solución de anticuerpo secundario y lavar con TBST 5x en una sierra de marel rockero de 45 a 60 minutos cada una a TA. Durante los lavados, mantener los explantes en la oscuridad. </li><li> Lleve a cabo un lavado adicional en TBST agita suavemente durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Postfix los explantes inmunoteñidas en PFA al 4% a 4 º C durante 10 min. </li><li> Lavar 2x 10 min con TBST. </li><li> La transferencia de los explantes o bien gradualmente en metanol 100% para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, o analizar inmediatamente. Para explantes cultivados en los filtros, y immunostained en una placa de 24 pocillos, de transferencia en una cámara de microscopía (por ejemplo LabTek o ibidi) con TBST o mejor medio de montaje fluorescente antes del análisis con un Multifotónica o microscopio confocal. </li></ol> 5. Extracción de ARN a partir de tiroides Trabajar en un ambiente libre de RNasa. Por lo tanto, el uso de ácido nucleico y libre de nucleasa puntas de pipeta y limpiar tanto el banco y el equipo de los contaminantes y RNasas. Este protocolo está basado en fenol / cloroformo, lleve a cabo el primer pasos (1-7) bajo una campana química. <ol><li> Homogeneizar un explante de la tiroides o dos lóbulos tiroideos con 300 l de solución de extracción de ARN utilizando un mortero desechable para tubo de 1,5 ml. En entre las muestras, lavar la mano del mortero en 2% de SDS, después con agua, después con etanol. </li><li> Añadir otros 100 l de solución de extracción de RNA, de vórtice 10 seg y se incuba a TA durante 10 min. </li><li> Vortex durante 30 segundos y se añaden 20 ng de tRNA para cada muestra. </li><li> Vortex durante 1 minuto y añadir 80 l de cloroformo. </li><li> Vortex vigorosamente durante 30 segundos e incubar 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugado durante 15 minutos a 19.000 xg en un (4 ° C) centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir cuidadosamente la fase acuosa superior incolora en un nuevo tubo que contiene 20 g de glucógeno como coprecipitante. </li><li> Vortex y añadir 200 l de 100% de alcohol isopropanol. </li><li> Vortex vigorosamente durante 15 a 30 segundos y dejar que el ARN precipitado a -20 º C durante 2-3 horas oa -80 º C durante 1 hora. </li><li> Haga girar durante 30 minutos a 19.000xg a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar el pellet con 450 l de etanol al 75% frío y agitar para desalojar el sedimento. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 19.000 xg a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. </li><li> Secar el pellet en la campana durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento con 10 l de agua libre de RNasa e incubar 10 min a TA. </li><li> La concentración de ARN de ensayo, almacenar a -80 ° C o revertir transcriben para el análisis de la expresión génica. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

En este trabajo se describe un método para la disección y el cultivo de explantes de la tiroides (E12.5) o lóbulos (E14.5) con el fin de estudiar y comprender mejor los complejos acontecimientos que conducen a la formación de la tiroides. Debido a la doble origen de la Anlagen tiroidea (la Anlage línea media y los dos cuerpos ultimobranquiales laterales), y su pequeño tamaño, un fragmento de tejido E12.5 rostral localizado en las arterias arco faríngeo, y que contiene la tráquea, pero no el esófago se microdis...

La glándula tiroides es una colección de esferas epiteliales independientes, llamados folículos, rodeado de una densa red de capilares endoteliales. Esta organización permite que la función tiroidea: capilares endoteliales proporcionan tirocitos con yodo, necesarios para T3 y T4 síntesis de la hormona, y distribuir estas últimas a todo el cuerpo. Dispersos en entre los folículos y los capilares, las células C producen la hormona calcitonina hipocalcémico 1. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides adultos son bien conocidos, los mecanismos celulares y moleculares implicados en el desarrollo embrionario de la tiroides (la formación del folículo y la diferenciación) están lejos de ser entendido. Durante la embriogénesis, tirocitos progenitoras se origina como un engrosamiento (el primordio de la línea media) de la pared ventral del endodermo del intestino anterior en el día embrionario (E) 8,5 en el embrión de ratón, mientras que las células C progenitores se originan en E11.5 como salientes en forma de gotitas-( la bo ultimobranquialmuere) de la cuarta bolsas faríngeas 2-6. El brote de la línea media a continuación, se separa de la endodermo, se expande bilateralmente para fusionar en E13.5 con los cuerpos ultimobranquiales en cada lado de la tráquea. Finalmente, tirocitos se organizan en folículos y células C diferencian. El conocimiento actual sobre la formación de tiroides proviene principalmente de análisis histológico de los tejidos fijos, pero los eventos morfogenéticos implicados en la formación de la tiroides son altamente dinámico e implican las comunicaciones e interacciones entre los diferentes tipos de células y con la matriz extracelular. Un trabajo reciente mostró que los progenitores tirocito producen altos niveles de VEGF para reclutar células endoteliales a la tiroides en desarrollo, y, a su vez, reclutan células endoteliales promueven la formación del folículo y la diferenciación de las células C 7. La mayoría de los estudios ex vivo en la tiroides se han realizado en adultos células derivadas de la tiroides-aislados, crecido ya sea en 2D de cultivo de tejidos de plástico dparroquias o en 3D matrices. El uso de estos tipos de cultivos, las células foliculares bien diferenciados permanecer polarizados y organizados en folículos o adquirir de nuevo una organización 3D 8-10. Sin embargo, estas células epiteliales puras, explantados de su entorno fisiológico, y se cultivaron en 2D, ignoran las interacciones con la matriz extracelular, citoquinas, factores de crecimiento y con otros tipos de células tales como las células endoteliales o los nervios que normalmente se encuentran in vivo. Un estudio muy agradable describió recientemente un protocolo de diferenciación de células madre embrionarias en los folículos tiroideos utilizando una etapa de cultivo final en 3D Matrigel 11. Sin embargo, estos cultivos 3D carecen de contacto con otros tipos de células. Basado en la experiencia anterior en el páncreas y las glándulas salivales de cultivo de órganos 12-14, un método para la disección de embriones de ratón Anlagen tiroides y el cultivo de los explantes sobre filtros semiporosas o en las diapositivas de plástico de microscopía fue desarrollado. ¿Cuándotrabajar con embriones E12.5, el doble origen de los esbozos de la tiroides (el esbozo de la línea media y los dos cuerpos laterales ultimobranquiales) impuso la microdisección de un gran fragmento de tejido. Este contenía la tráquea, pero no el esófago, y se extendió desde el arco faríngeo arterias hasta que la hinchazón aritenoides. Cuando se cultivan en filtros, el primordio de la línea media se extiende lateralmente a cada lado de la tráquea, donde se fusionan con los cuerpos ultimobranquiales para formar los dos lóbulos tiroideos, todavía conectadas por un estrecho istmo. En cultivo, las células epiteliales proliferan, se organizan en folículos y se diferencian en tirocitos y células C, dependiendo de su origen. Las células endoteliales contenidas en el tejido microdissected también proliferan e invaden los lóbulos tiroideos para finalmente asociar estrechamente con la estructura folicular epitelial, independientemente del flujo de sangre o factores circulantes. Dado que el desarrollo de los explantes recapitula fielmente en vivo desarrollarción, este sistema de cultivo es óptima para estudiar morfogenética y eventos de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides. Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes, y el sistema de cultivo es susceptible a la pérdida-y los experimentos de ganancia de función. Por último, time-lapse de explantes de tiroides marcados con fluorescencia en placas de plástico de microscopía podría ser explotada para investigar mejor la cinética y la continuidad de los movimientos morfogenéticos que se producen in vivo. Time-lapse ya se ha utilizado para estudiar la morfogénesis de ramificación del páncreas 15,16 o la yema ureteral 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

La tiroides es una glándula endocrina bilobated localizada en la base del cuello, la producción de las hormonas tiroideas T3, T4, y la calcitonina. T3 y T4 son producidos por tirocitos diferenciadas, organizadas en ámbitos cerrados llamados folículos, mientras que la calcitonina es sintetizada por las células C, intercalados entre los folículos y una densa red de capilares sanguíneos. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides de adultos han sido ampliamente descritos y estudiados, la formación de las unidades &quot;angio-foliculares&quot;, la distribución de células C en el parénquima y los comunicaciones paracrina entre las células epiteliales y endoteliales está lejos de ser comprendido. Este método describe los pasos secuenciales de ratón tiroides embrionario disección esbozos y su cultura en los filtros semiporosas o en diapositivas de plástico de microscopía. Dentro de un período de cuatro días, este sistema de cultivo recapitula fielmente en el desarrollo de la tiroides vivo. De hecho, (i) BILobation del órgano se produce (para explantes E12.5), (ii) tirocitos precursores se organizan en folículos y polarizan, (iii) tirocitos y células C diferencian, y (iv) las células endoteliales presentes en el tejido microdissected proliferan, migran a la lóbulos tiroideos y estrechamente se asocian con las células epiteliales, como lo hacen en vivo. Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes. Por otra parte, los explantes de cultivo se puede manipular mediante la adición de inhibidores, el bloqueo de anticuerpos, factores de crecimiento, o incluso células o medio acondicionado. Ex vivo de desarrollo se puede analizar en tiempo real, o en cualquier momento de la cultura mediante inmunotinción y RT-qPCR. En conclusión, el cultivo de explantes de tiroides combinado con aguas abajo todo el montaje o en secciones de imagen y la expresión de genes de perfiles proporciona un sistema eficaz para la manipulación y el estudio de morfogénesis y diferenciación de eventos o de la tiroidesrganogenesis.

Anlages tiroides (la línea media y la UB, junto con los tejidos circundantes) y lóbulos tiroideos son disecados de embriones de ratón en E12.5 y e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Después de un día de cultivo en el filtro, la Anlage línea media es visible (Figura 2A) como un tejido alargado que abarca en la parte superior de la tráquea. Se forma progresivamente dos lóbulos en cada lado de la tráquea. Si lóbulos tiroideos aislados (E13.5 E14.5) o se cultivan, se expanden,...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K vistas.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Video: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...