Mejorar el aroma de la fruta es uno de los principales objetivos en los programas de mejoramiento. Para ello, necesitamos una técnica fiable que nos permita medir componentes volátiles en frutas. Esta técnica es rápida y semiautomatizada, permitiendo medir hasta 22 muestras por día.
Además, es relativamente barato y requiere un procesamiento mínimo de muestras. Este método se puede aplicar fácilmente para todas las especies frutales, como los cultivos de bayas económicamente importantes. Además, el tamaño de la biblioteca del compuesto detectado se puede aumentar fácilmente.
Para comenzar, agregue un mililitro de solución de cloruro de sodio a un tubo de cinco mililitros que contenga la muestra congelada del vadeo. Agite el tubo hasta que la muestra esté completamente descongelada y homogeneizada. Luego centrífuga a 5, 000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Corte el extremo de la punta de la pipeta de 1.000 microlitros y úsela para transferirla al sobrenadante al cloruro de sodio que contiene la lima de espacio para la cabeza. Agregue cinco microlitros de estándar interno a cada muestra que contenga el archivo headspace. Coloque el archivo de espacio de cabeza cerrado en un muestreador automático GC-MS, a temperatura ambiente, para una ejecución automatizada de HS-SPME/GC-MS, asegurándose de que las réplicas biológicas no se coloquen en posiciones sucesivas en el muestreador automático.
Preincuba los archivos de espacio de cabeza durante 10 minutos a 52 grados Celsius con agitación a 17 veces G.Inserte un dispositivo SPME en el vial para exponer la fibra al espacio de cabeza y realice la extracción de COV durante 30 minutos a 50 grados Celsius con agitación a 17 veces G.Introduzca la fibra en el puerto de inyección durante un minuto a 250 grados Celsius en modo sin división para la desorción volátil. Luego limpie la fibra en una estación de limpieza SPME con nitrógeno durante cinco minutos a 250 grados centígrados. Analice los COV con un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de iones como se describe en el manuscrito de detección.
Abra los archivos de perfil GC-MS sin procesar. Para identificar compuestos, compare los tiempos de retención, los espectros de masas y los índices de retención lineal de Kovats con los índices de retención obtenidos a partir de estándares auténticos. Para cada estándar comercial, anote el tiempo de retención en la masa más abundante para cargar iones.
A continuación, seleccione un ion M por Z específico para cada COV. Calcule el área de pico de cada COV en relación con la del estándar interno para minimizar la variación instrumental y la deriva de intensidad. Para la corrección del efecto por lotes, normalice el área de pico de COV de cada muestra al área de pico correspondiente en la muestra de control analizada en la misma ejecución.
Un perfil de cromatograma de iones totales volátiles de frutos de grosella negra maduro obtenido por HS-SPME/GC-MS identificó 63 COV pertenecientes a ésteres, aldehídos, alcoholes, cetonas, terpenos y furanos basados en una biblioteca que se desarrolló para perfilar especies de frutos de bayas. Algunos de los picos más abundantes observados corresponden a dos monoterpenos, linalool y terpineol, y dos compuestos C6, 2-hexenal y 3-hexenal. Los espectros de masas obtenidos a partir de perfiles de corriente negra en su comparación con espectros de estándares comerciales puros se muestran para 2-hexenal y terpineol.
El PCA de los perfiles de COV de cuatro cultivares de corriente negra diferentes, mostró que el medio ambiente afecta fuertemente el contenido volátil, ya que PC1 separa las muestras en función de su ubicación. El genotipo efectivo se puede observar con PC2, ya que Ben Tirran está claramente separado de los cultivares restantes. El contenido relativo de linalool y 2-hexenal en los cuatro cultivares de corriente negra evaluados confirma que el contenido de linalool fue generalmente mayor en Polonia que en Escocia, mientras que 2-hexenal mostró la tendencia opuesta.
La proporción de linalool fue más alta en los cultivares de Ben Tirran, en la de 2-Hexenal fue más alta en los cultivares de Ben Tron. Es importante comenzar con material congelado, molido en un polvo fino para asegurar una extracción volátil adecuada. Una vez extraída, la muestra debe colocarse en el muestreador automático, tan pronto como sea posible.
Este método se puede combinar con otra plataforma metabólica para identificar otros metabólicos importantes, para el sabor de los alimentos o el valor nutricional, para criar variedades con características organolépticas mejoradas.
