Este protocolo utiliza células madre pluripotentes inducidas para diferenciarlas en células pulmonares con el fin de modelar la enfermedad pulmonar humana y el desarrollo en un plato. Este protocolo es significativo porque es difícil obtener y cultivar tejido pulmonar humano primario. Las principales ventajas de diferenciar las células pulmonares de las células madre pluripotentes es tener un suministro constante de células pulmonares específicas para estudiar el desarrollo y la enfermedad pulmonar humana.
Estas células se pueden mantener en cultivo celular durante largos períodos de tiempo, se pueden criopreservar para aplicaciones futuras y se pueden manipular genéticamente para estudiar mutaciones genéticas. Demostrando el procedimiento estará Rachel McVicar, una candidata a doctorado de mi laboratorio. Antes de comenzar el experimento, descongele lentamente un medio de matriz de membrana basal reducido de factor de crecimiento, o GFR, en hielo, y diluirlo en un volumen igual de DMEM F12 frío.
Coloque las puntas P1000 en el congelador para enfriar antes de usar. A continuación, cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 microlitros del medio de matriz de membrana basal 50% GFR, y elimine cualquier exceso de mezcla media y burbujas de los pozos. Coloque las placas del pozo sobre hielo húmedo o un refrigerador a cuatro grados Celsius para que se fije durante 20 minutos, luego mueva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.
Cuando los PSE altos alcancen el 70% de confluencia, agregue 10 inhibidores micromolares de ROCK Y27632 a las células madre pluripotentes inducidas por humanos y espere una hora antes de la disociación. Aspire los medios y lave las células una vez con PVS. Disociar las IPSC agregando 500 microlitros de medio de desprendimiento celular por pozo, e incubar durante 20 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de paso de células madre por pozo. Pipete suavemente las celdas usando una punta P1000 para obtener una suspensión de una sola celda. Luego transfiera las células disociadas a un tubo de 15 mililitros y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Después de la centrifugación, aspire el medio y resuspenda el pellet celular con un mililitro de medios mTeSR Plus complementado con un inhibidor de ROCK micromolar de 10.
Después de contar las células, agregue dos veces 10 a las quintas IPSC a cada pocillo de una placa recubierta de medio GFR de 12 pocillos, e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, aspire el mTeSR Plus antes de agregar medios de inducción endodermo definitivos, o DE. En los días dos y tres, cambie los medios de inducción DE.
En el cuarto día, comience la inducción de AFE reemplazando los medios de inducción de DE con medio basal sin suero. Cambie el medio AFE diariamente durante tres días antes de analizar la eficiencia de AFE al final del sexto día. En el séptimo día, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo para su uso posterior.
Simultáneamente, proceda con la diferenciación de células progenitoras pulmonares aspirando los medios AFE y lavando los pozos con PVS. Agregue un mililitro de solución de desprendimiento celular al pozo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue un mililitro de medios de enfriamiento a los pozos que contienen la solución de desprendimiento celular.
Mantenga las celdas como agregados canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Asegúrese de que todas las células estén desalojadas, pero para transferirlas a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medios de inducción LPC.
Cuente las células y agregue 2.5 veces 10 a las quintas células a 100 microlitros de medio de matriz de membrana basal de GFR fría y mezcle bien. Coloque una gota en un pozo de una placa de 12 pocillos e incube a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. A continuación, agregue un mililitro de medios LPC por pozo, asegurándose de que la gota media esté completamente sumergida e incube durante la noche a 37 grados centígrados.
En el octavo día, cambie el medio LPC para eliminar el inhibidor de ROCK Y27632. Siga cambiando los medios cada dos días y analice la eficiencia de LPC al final del día 16. El día 17, lave los pozos y agregue 500 microlitros de dos microgramos por mililitro de dispasa.
Pipetear la mezcla dispase con una pipeta P1000 e incubar durante 15 minutos, luego pipetear la mezcla e incubar durante otros 15 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro del medio de enfriamiento a los pocillos que contienen dispasa y transfiera las células a tubos cónicos. Centrifugar y volver a suspender el pellet en un mililitro de PVS refrigerado, luego repetir la centrifugación.
Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de desprendimiento celular. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 12 minutos, luego agregar un volumen igual de medios de enfriamiento y centrifugar nuevamente. Resuspend el pellet en un mililitro de medios de enfriamiento y 10 micromolares inhibidor de ROCK Y27632.
Realice un recuento de células para calcular el volumen necesario para obtener ocho veces 10 a la cuarta celda por pozo. Luego, la alícuota requirió el volumen de agregados de células lpC en tubos de micro centrífuga de 1.5 mililitros, y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Retire el exceso de sobrenadante sin agitar el gránulo celular, dejando 10 microlitros de medios residuales. Resuspend el pellet celular en 200 microlitros de medio de matriz de membrana basal GFR frío y transfiera las células a insertos de membrana de cultivo celular.
Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de inducción organoide 3D a la cámara basolateral del inserto y reemplácelo con medio fresco cada dos días durante seis días. El día 23, cambie el medio a un medio de ramificación 3D, luego cambie el medio cada dos días durante seis días.
El día 29, cambie al medio de maduración 3D y continúe reemplazando el medio cada dos días durante los próximos seis días. En el cuarto día de inducción de DE, las células adheridas muestran una morfología de adoquines compacta. Se expresaron los marcadores endodermos definitivos CXCR4 y SOX17 superpuestos con núcleos, confirmando la diferenciación endodérmica.
La inducción del intestino anterior se confirmó en el séptimo día con la morfología mostrando células más compactas, y los marcadores FOXA2 y SOX2 superpuestos con núcleos. La generación de células progenitoras pulmonares 3D se confirmó con esferoides 3D y la expresión endógena de NKX2-1 GFP en una línea celular reportera. Después de una diferenciación de tres semanas en organoides pulmonares enteros, los marcadores pulmonares se analizaron mediante inmunocitoquímica.
Se observaron marcadores de morfogénesis ramificada SOX2 y SOX9 superpuestos por núcleos en los organoides. Los marcadores pulmonares proximales P63 y KRT5, ambos marcadores de células basales, se detectaron con éxito junto con SCGB3A2, que es un marcador para las células club. Los marcadores pulmonares distales indujeron marcadores Pro SPC y SPB para células alveolares tipo II.
Y marcadores HOPX de células alveolares tipo I. Además, NKX2-1 y ZO1 se expresaron superpuestos con núcleos. Los marcadores de células pulmonares mesénquimas PGFR Alfa, un marcador para fibroblastos, coexpresado con SOX9, representaban el mesénquima distal.
También se expresó vimentina y se dispersó por todo el pulmón. Después de este procedimiento, los organoides pulmonares se pueden invertir con células madre pluripotentes inducidas derivadas de células madre endoteliales e inmunes. El desarrollo pulmonar y la enfermedad se producen por una señalización entre las poblaciones de células epiteliales y mesenquimales, pero también de las células endoteliales y los macrófagos.
Un sistema modelo de tejido pulmonar en 3D es clínicamente relevante para estudiar enfermedades humanas y terapéuticas.
