El aislamiento de poblaciones clave de progenitores de megacariocitos permite el análisis fino de la jerarquía de linaje en cultivo celular en ensayos moleculares, hasta el nivel de una sola célula. Este protocolo combina una práctica más ética al minimizar el número de animales requeridos, en un proceso eficiente para la clasificación celular de las poblaciones MEP y MKP. Para el hueso, rocíe el cuerpo de un ratón negro C57 de seis de ocho a 12 semanas de edad, con 70% de etanol.
Use tijeras para hacer una incisión de cinco a un centímetro de la piel, perpendicular a la columna vertebral. Y rasgar la piel alrededor de todo el cuerpo, tirando de ella hacia abajo. Coloque el ratón boca abajo en la almohadilla de disección, luego ubique los huesos pélvicos deslizando los dedos o tijeras, a lo largo de la columna vertebral expuesta, de arriba a abajo.
Para localizar la cresta ilíaca, identifique la pequeña protuberancia en la región lumbar cerca de las extremidades posteriores. Después de colocar las tijeras paralelas a la columna vertebral, contra las vértebras, y cerca de la protuberancia de la cresta ilíaca, proceda a cortar los músculos a lo largo del lado de la columna vertebral por encima del hueso pélvico, deslizando las tijeras a lo largo de las vértebras, hasta la cola. Luego corte entre las vértebras y la cresta ilíaca, permaneciendo lo más cerca posible de las vértebras.
Y corte los músculos restantes para separar la extremidad del cuerpo. Transfiera las extremidades desprendidas a una superficie limpia. Después de desechar el resto del cuerpo de acuerdo con las pautas institucionales, use pórceps y bisturíes para exponer los huesos pélvicos, femorales y tibiales, mediante la eliminación del tejido circundante.
Use forrceps para sostener el extremo distal del fémur y disloque cuidadosamente la cabeza femoral del hueso pélvico, cortando suavemente los músculos alrededor de la articulación con un bisturí. Raspe el músculo restante del hueso pélvico y corte en el medio de la cavidad que sostenía la cabeza femoral. Mantenga el ilion y deseche el lado delgado triangular del hueso.
Usando un bisturí, retire los tejidos residuales alrededor del ilion y coloque el hueso limpio en PBS estéril suplementado con 2% Newborn Calf Serum. Luego use tijeras para cortar el pie de la pierna en el tobillo. Sosteniendo la parte inferior de la tibia con las pórceps, raspe el músculo hacia la rodilla.
Deseche el peroné. Luego haga un corte a través de la meseta tibial con el bisturí y coloque la tibia en PBS estéril 2% NBCS. Después de extraer los tejidos residuales alrededor del fémur, sostenga la parte superior del fémur con bórceps y coloque la hoja del bisturí en la base de la rótula.
Aplique una fuerza hacia la rótula, paralela al fémur para separar la rótula. Luego coloque el fémur, en PBS estéril 2% NBCS. En un gabinete de flujo laminar, transfiera los huesos a una placa de Petri estéril llena de PBS estéril 2% NBCS.
Use un bisturí para cortar la cabeza de los fémures. Llene una jeringa de un mililitro con PBS estéril 2% NBCS y conecte una aguja de calibre 21 a la salida. Luego llene un tubo de polipropileno de cinco mililitros con dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS.
Sosteniendo el fémur con fórceps, inserte la aguja en el surco izquierdo, después de la extracción de la rótula aplicando rotación, asegurándose de que la aguja se inserte completamente en el hueso, hasta el bisel. Después de la inserción de la aguja, transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2%NBCS. Luego dispense y aspire el PBS 2% NBCS, desde la jeringa hasta que el hueso esté claro.
Retire la aguja del fémur e insértela en el orificio del lado opuesto, donde estaba la cabeza del fémur. Después de dispensar y aspirar el tampón, deseche el hueso. Para la cresta ilíaca y la tibia, use forrceps para sostener el hueso e inserte suavemente la aguja en el lado abierto, aplicando rotación.
Asegurarse de que la aguja esté completamente insertada en el hueso, hasta el bisel. Luego transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2% NBCS. Dispense y aspire el PBS 2%NBCS de la jeringa hasta que el hueso esté claro.
Pase toda la suspensión celular a través de una tapa de colador de células de 40 micras, colocada en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, y agregue 500 microlitros de PBS 2% NBCS. Reservar 100 microlitros de la suspensión celular como médula ósea total. Luego guárdelo en hielo para el procedimiento de tinción.
Pellet la suspensión filtrada por centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet en un cóctel de anticuerpos primarios recién preparado, con la incubación en hielo, durante 30 a 45 minutos. Apartar 10 microlitros de la suspensión celular en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, etiquetado como Lin Pores Fraction, y añadir 90 microlitros de PBS 2%NBCS.
Mientras tanto, prepare una cuenta para el agotamiento magnético, resuspendiéndolas en el vial, con un vórtice completo durante 30 segundos. Transfiera un volumen de perlas correspondiente a dos perlas por celda objetivo, en un tubo de polipropileno de cinco mililitros, y lave las perlas dos veces, con PBS 2% NBCS, colocando el tubo en el imán. Después de retirar el tampón de lavado con una pipeta pasteur de vidrio estéril, vuelva a colocar las perlas en 500 microlitros de PBS estéril 2% NBCS.
Para el primer paso del agotamiento magnético, agregue 250 microlitros de perlas sobre el pellet de células lavadas e incube con una mezcla suave durante cinco minutos en hielo. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS, con una mezcla suave, y coloque el tubo en el imán durante dos minutos. Proceda a recoger la fracción no magnética con una pipeta pasteur de vidrio estéril.
Y para el segundo paso del agotamiento magnético, agréguelo a los 250 microlitros restantes de cuentas magnéticas. Coloque el tubo sellado con parafina en un rodillo de tubo, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS con una mezcla suave.
Y coloque el tubo con el imán durante dos minutos. Recoja la fracción no magnética en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros, etiquetado, fracción Lin Neg no magnética, con una pipeta pastreur de vidrio estéril, y proceda con la clasificación celular de los progenitores de megacariocitos, como se describe en el manuscrito de texto. Para la estrategia de gating para la clasificación celular, en la población de Lin Neg, se seleccionan las células que expresan C-kit y una expresión baja o nula del antígeno Sca-1 o CD16/32.
En esta población, los MEP se identifican como células CD150 positivas y CD9 dim. El MKP como CD150 positivo, y las células brillantes CD9. En el Análisis de Citometría de Flujo representativo, las células identificadas como MEP y Mkp, fueron etiquetadas con anticuerpos conjugados de fluorescencia para cd41a, y marcadores clásicos CD42c, de los linajes megacariocítico y plaquetario.
Ambos marcadores fueron expresados por las células de la población MKp, y no fueron detectados en la superficie de las células de la población MEP. El contenido de ADN de los megacariocitos clasificados, demostró que las células son en su mayoría 2n para la población MEP. Y una pequeña porción de las células MKp son extrañas.
Las células de ploidy más altas no se detectaron significativamente en estas poblaciones. En ensayos clonogénicos semisólidos, se detectó UFC-MK en poblaciones de MEP y MKp. BFU-E no se detectó en la población MKp, pero se detectó en MEP y, la población de células progenitoras CD9 negativas CD150.
La observación microscópica en el tercer día de diferenciación, muestra que MEP y MKp produjeron principalmente megacariocitos, identificados como células grandes. Los megacariocitos obtenidos después de tres días de cultivo, se identificaron utilizando la expresión de CD41 y CD42c, y representan el 54, y el 82% de las células producidas a partir de poblaciones de células MEP y MKp, respectivamente. La ploidía de los megacariocitos producidos, fue mayor a partir del megacariocito derivado de la población MKp, en comparación con la población MEP.
Solo las células derivadas de la población MKp, fueron capaces de emisión de proplatelet, lo que sugiere una etapa de maduración más avanzada para la población MKp. El uso del hueso pélvico, aumenta drásticamente al número de células, mientras que el agotamiento magnético de dos pasos mejora la eficacia del agotamiento del linaje. Este protocolo permite el posterior cultivo de la población MEP y MKp de células individuales, que, junto con el análisis transcriptómico y proteómico, sin duda tendrá que descifrar los mecanismos implicados, implementados en la biogénesis.
