Reprogramación directa de linajes de fibroblastos a células progenitoras de eritroide. Es un nuevo método que hemos desarrollado en nuestro laboratorio con el fin de estudiar mejor los procesos de regulación transcripcional que determina el destino de las células eritroideas. La principal ventaja de utilizar la reprogramación directa del linaje para estudiar el desarrollo es que es una técnica muy sencilla.
Así que en comparación con, por ejemplo, la pérdida de estudios de función dentro de ratones knockout, aquí podemos manipular muy fácilmente el factor, sobre-expresarlo en el punto de tiempo determinado, y luego obtener fácilmente suficiente material para estudiar efectos aguas abajo como modificaciones de cromatina o cambios en la expresión génica. Mientras que este método se centra en la reprogramación de fibroblastos de punta de cola de ratón a progenitores de eritroides, también se puede aplicar a otros tipos de células de fibroblastos, y a otros organismos incluyendo a los seres humanos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la medicina transfusional, ya que allana el camino hacia la producción de glóbulos rojos in vitro.
Demostrando el procedimiento estará Alban Johansson de mi grupo de investigación. Comienza cubriendo la superficie de los platos con 0,1%gelatina. Incubarlos a 37 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos.
Aspirar la solución de gelatina y dejar que los platos se sequen. Utilice tijeras para cortar en la base de la cola de un ratón eutanizado para quitarlo. Coloque la cola en DPBS con 2%FBS hasta que esté listo para usar.
En una capucha de cultivo de tejido en condiciones estériles, preparar una solución diluida de trippsina de 0.02%trypsin EDTA en DPBS y añadir 5 mililitros en un plato de 10 centímetros sin recubrimiento. En una capucha de cultivo de tejido, lave la cola en suficiente 70%etanol en un tubo de 15 mililitros para cubrirla y luego en DPBS. Coloque la cola plana en un plato y use fórceps para mantenerla en su lugar.
Utilice un bisturí para hacer una incisión en la cola a lo largo de su eje longitudinal desde la base hasta la punta. Usa un par de fórceps para agarrar la cola y sostenerla verticalmente y usa un segundo par para agarrar la piel junto a la incisión en la base de la cola y pelarla hacia atrás. Realice esto a ambos lados de la incisión hasta que la piel se pueda pelar tirando hacia abajo hacia la punta de la cola.
Sostenga la cola pelada con fórceps sobre el plato que contiene la solución de trippsina. Utilice tijeras de disección para cortar la cola en trozos pequeños. Use tijeras para fragmentar estas piezas en la solución de la trippsina en trozos aún más pequeños y luego incubar a 37 grados Centígrados durante 10 minutos.
Para apagar la tripín, añadir dos volúmenes de medio FEX, DMEM con suplementos y antibióticos. Recoger todo el contenido del plato en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene los fragmentos de cola en 10 mililitros de medio FEX fresco. Transfiera esta suspensión a un plato recubierto de gelatina. Incubar a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono y 4%oxígeno, añadiendo un medio FEX fresco cada dos días.
Observar el cultivo después de cinco a siete días, en los que los fragmentos de cola se han unido en la parte inferior del plato, y los fibroblastos se están alejando de ellos. Una vez que los racimos de fibroblastos sean visibles, agita suavemente el plato para desalojar las piezas de la cola. Aspirar el medio con todos los fragmentos óseos, dejando los fibroblastos unidos a la placa.
Añadir 10 mililitros de medio FEX fresco y cultivar los fibroblastos hasta que se confluen. Para asegurarse de que no haya contaminación por progenitores hematopoyéticos en el cultivo de fibroblastos, disociar las células de la placa utilizando la trippsina EDTA como se describe en el manuscrito. Añadir medio y recoger las células, y añadir cuentas magnéticas con anticuerpos.
Utilice un sistema de separación magnética para eliminar las células que expresan marcadores hematopoyéticos. Incluir este paso es absolutamente vital porque elimina cualquier HSPC que pueda estar presente en la cultura y, por lo tanto, la probabilidad de falsos positivos el día del análisis FACS. Células de envasado retroviral de semillas a aproximadamente 25.000 células por centímetro cuadrado en un plato tratado con cultivo de tejido.
Incubar las células en DMEM de alta glucosa a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, retire el medio y agregue la mitad del volumen utilizado para cultivar durante la noche de DMEM sin aditivos. Por la tarde, revise las celdas para 70 a 80% de confluencia requerida para la transfección.
Comience la transfección preparando una mezcla de dos a uno de seis microgramos del vector de expresión PMX y tres microgramos del vector auxiliar que contiene los genes Gag, Pol y envelope para cada factor de reprogramación. A continuación, para cada factor de reprogramación, agregue 300 microlitros de DMEM de temperatura ambiente en un tubo de poliestireno estéril. A continuación, añada cuidadosamente 27 microlitros de reactivo de transfección comercial a temperatura ambiente directamente en el medio para evitar el contacto con la pared del tubo.
Añadir la mezcla de plásmido en el reactivo de transfección que contiene el tubo. Vortex brevemente e incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vórtice la mezcla de ADN del reactivo de transfección de nuevo.
Añádalo por gota a las células de envasado retroviral para que se extienda uniformemente sobre el cultivo e incubar a 37 grados centígrados. 24 horas después de la transfección, retirar el medio y añadir DMEM con 20%FBS y 100 unidades por mililitro penicilina estreptomicina. 48 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros tamaño poro.
Comience la transducción sembrando los fibroblastos de la punta de la cola a 10.000 células por centímetro cuadrado en 0.1%gelatina platos pre-recubiertos en medio FEX. Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al llevar a cabo este paso, es importante añadir los cuatro sobrenadantes retrovirales a la misma proporción para garantizar que los cuatro transgenes contribuyan por igual al proceso de reprogramación.
Al día siguiente, preparar una mezcla de transducción añadiendo primero un volumen de sobrenadante viral para cada factor de reprogramación complementado con cuatro microgramos por mililitro de reactivo de infección retroviral a seis volúmenes de medio FEX. Después de eso, aspirar el medio FEX del cultivo de fibroblastos y añadir la mezcla de transducción. Incubar la reacción de transducción durante cuatro horas a 37 grados centígrados en condiciones hipoxiales con un 5% de dióxido de carbono y un 4% de oxígeno.
Después de cuatro horas, aspirar la mezcla de transducción y añadir un nuevo medio de reprogramación. Incubar a 37 grados centígrados en condiciones hipoxiales durante ocho días, añadiendo un nuevo medio de reprogramación cada dos días. Observe la reprogramación exitosa con racimos producidos de células desprendidas de la placa.
Para cosechar las células reprogramadas del plato para su posterior análisis, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y luego recoja las células. Después de la reprogramación exitosa de iEP, las células positivas de YFP son observables tan pronto como cinco días después de la transducción. Se vuelven redondos, se levantan de la superficie de la placa, comienzan a formar racimos y muestran una morfología similar a un precursor de los eritroides.
La hemoglobinización de algunas células es evidente por la tinción positiva de benzidina. Una pequeña fracción expresa el marcador de superficie específico de eritroide TER-119. Para el octavo día, se pueden ver grandes clústeres positivos de YFP.
Los iEP de día ocho tienen un fenotipo eritroid más diferenciado que el cinco iEP del día. Son significativamente más pequeños, han acumulado más hemoglobina, y muestran una mayor expresión de TER-119. El análisis de la expresión génica por qPCR de iEP recogidos en el día ocho muestra que casi han apagado la expresión de genes de fibroblastos y han regulado al máximo muchos genes eritroides.
Después de realizar ensayos formadores de colonias de BFU-e en las células reprogramadas, el día ocho iEP forman dos tipos de colonias, claramente rojas y no visiblemente rojas. Mientras que las células de las colonias rojas mostraban morfología eritroblasta, las células de colonias no rojas no lo hacían. Aproximadamente una de cada 1.000 días cinco iEPs formaron colonias rojas, mientras que sólo aproximadamente una de cada 10.000 colonias se formó a partir del día ocho iEPs.
La eficiencia de reprogramación de fibroblastos o TTF de la punta de cola está influenciada por el número de pasaje. Los TTF que habían sido contados nueve veces mostraron una reducción dramática en la capacidad de producir grupos de iEP en comparación con las células que habían sido pasajes tres veces. Además, las diferentes condiciones de cultivo pueden afectar a la eficiencia de la reprogramación.
Los TTF transducidos cultivados en la normoxia son mucho más lentos de reprogramar y los grupos del IEP se observan después de 10 días en lugar de cinco a ocho días. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar métodos como ensayos formadores de colonias, análisis qPCR y FACS para determinar el estado de diferenciación celular. Desde su desarrollo, esta técnica está allanando el camino para los investigadores en el campo de la eritropoyesis en la comprensión del cambio entre las células eritroides primitivas y definitivas en el ratón y el ser humano.
