Este protocolo propone un método sencillo para la obtención de progenitores hematopoyéticos humanos, y para inducir su diferenciación en megacariocitos. Puede servir como base para una mejor comprensión de la megacaropoyesis Esta técnica utiliza una fuente, pero ofrece la ventaja de ser asequible y abundante para la investigación de laboratorio en hematopoyesis. Este método se utiliza para comprender mejor la megacaropoyesis para que la célula se utilice en la terapia, deberá prepararse en las condiciones GMP, lo que actualmente no es el caso.
Comprender los pasos, incluida la colección PBMC, solo puede completarse completamente con una demostración visual. Antes de comenzar un experimento, conecte un filtro de leucorreducción a una bolsa de transferencia vacía de 600 mililitros y a un juego de tubos. En un gabinete de bioseguridad, inyecte 25 mililitros de tampón de elución filtrado por filtro de leucorreducción en la bolsa vacía y use una jeringa de 30 mililitros para aspirar suavemente el contenido de la bolsa a través del filtro.
Transfiera los glóbulos rojos recolectados a un nuevo tubo de 50 mililitros y diluya la suspensión celular a la mitad con 2% de dextrano. Mezcle bien para agregar las células sanguíneas y permita que las células se sedimenten durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando los glóbulos rojos se hayan asentado, transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros y llene el tubo con dos solución milimolar de PBS EDTA.
Superponga suavemente la mitad del sobrenadante sobre 25 mililitros de medio de gradiente de densidad en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros sin perturbar la superficie del gradiente y separe las celdas mediante centrifugación por gradiente de densidad. Utilice una pipeta desechable para transferir las células de cada interfaz a un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave las células dos veces en 50 mililitros de PBS EDTA milimolar por lavado.
Después del segundo lavado, vuelva a gastar los gránulos en un solo volumen de 50 mililitros de PBS EDTA fresco para contar. Aquí es posible detener el procedimiento manteniendo las células recolectadas bajo agitación a cuatro grados centígrados durante la noche. Para la selección de células CD34+, determine el número de células y recoja las células por centrifugación y resuspiva el pellet celular en 300 microlitros de dos milimolares PBS EDTA por 10 a la octava célula.
Agregue el volumen apropiado de reactivo bloqueador del receptor FC y 50 microlitros de microperlas CD34 por 10 a las octavas células. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células con dos PBS EDTA milimolares y vuelva a gastar el pellet en 500 microlitros de PBS EDTA fresco de dos milimolares, por 10 a las ocho células. Humidifique y dimensione adecuadamente la columna magnética con PBS EDTA y, a continuación, agregue la muestra a la columna.
Lave la columna dos veces con tres mililitros de pbS EDTA milimolar por lavado. Antes de eludir las células CD34+, con dos volúmenes de cinco mililitros de dos milimolares PBS EDTA por elución. Para evaluar la pureza de las células seleccionadas de perlas magnéticas, agregue dos microlitros de un anticuerpo humano anti CD34 apropiado a una alícuota de 100 microlitros de las células aisladas y mezcle bien antes de incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, lave las células en PBS y resuspenda el pellet en 200 microlitros de PBS para el análisis de la pureza de la muestra celular por citometría de flujo. Después de contar, recoja las células CD34 + por centrifugación e inmediatamente vuelva a suspender el pellet en solución fría uno a una densidad de 10 a las seis celdas por mililitro antes de agregar rápidamente la suspensión celular a la solución fría dos. Luego, coloque inmediatamente el tubo criogénico en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 24 horas antes de transferir el tubo criogénico al almacenamiento de nitrógeno líquido.
En este estudio representativo, las células fueron recuperadas por filtración de leucorreducción como se demostró con una viabilidad aproximada del 95%. Después de la selección de perlas magnéticas, se obtuvo una población de células CD34+ puras superior al 90%. La proliferación celular generalmente disminuye después de una semana de cultivo, pero sin cambios significativos en la viabilidad celular.
Para el séptimo día, las células CD34+ deben comenzar a expresar CD41, un marcador específico y temprano o para el desarrollo de megacariocitos y plaquetas. Para el día 10, la mayoría de las células en el cultivo generalmente se convierten en megacariocitos cd41 maduros que expresan. Para el día 13, la extensión plaquetaria pro megacariocito y la liberación de plaquetas se pueden observar mediante microscopía de luz.
El número total de CD41, CD42, 8 plaquetas positivas liberadas en el cultivo se puede cuantificar utilizando un número calibrado de perlas fluorescentes. Este método allana el camino para mejorar los mecanismos subyacentes de la megacaripoyoyesis y para aumentar los rendimientos de plaquetas en visual. Incluso si este método parece tedioso, es muy simple, solo necesita ser paciente y preparar todas las regiones con anticipación.
Aunque nuestra megacaropoyesis de preocupaciones críticas, obtenemos células CD42 que se pueden usar en vías hematopoyéticas.
