Este protocolo permite aislar y cultivar con éxito fibroblastos asociados al cáncer primario del cáncer de mama murino, para detectar nuevas nanopartículas diseñadas para dirigirse al microambiente tumoral. El CAF primario representa el modelo más fiable y fisiológico para los estudios in vitro del estroma tumoral. En este protocolo, describimos cómo lograr un rendimiento óptimo.
Para comenzar, prepare una mezcla de digestión para la disociación del tumor y remoje los fragmentos tumorales de tres a cinco milímetros en la solución después de cerrar firmemente el tubo. Gire el tubo boca abajo, comprobando que todas las piezas del tumor estén en la parte inferior del tubo hacia la tapa. Luego conecte el tubo a un disociador mecánico en la carcasa adecuada y ejecute un programa de disociación diseñado específicamente para tumores difíciles.
Después de la carrera, desmonte el tubo y colóquelo boca abajo para incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 40 minutos con un suave agitación. Luego vuelva a conectar el tubo al disociador en la carcasa adecuada y ejecute el programa de disociación para tumores difíciles dos veces, asegurándose de que no queden grandes piezas de tejido al final del procedimiento. Filtre la muestra a través de un colador de células de 40 micras en un tubo de 50 mililitros.
Luego lave el filtro con 10 mililitros de medio RPMI 1640 y centrífuga. Después de la centrifugación, vuelva a colocar el pellet en tampón PBE, compuesto por PBS, 0.5% BSA y EDTA milimolar, y cuente las células con trypan blue. Repare el tampón de unión de eliminación de células muertas diluyendo la solución de almacenamiento de tampón de unión 20X con agua destilada doble estéril.
Lave las células con cinco mililitros de tampón de unión 1X y centrífuga. Después de la centrifugación, vuelva a colocar el pellet celular con 0,1 mililitros de microperlas de eliminación de células muertas durante un máximo de 10 a la séptima célula, e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, prepare un soporte magnético debajo del capó y cuelgue columnas de separación ferromagnéticas, con las puntas apuntando hacia abajo.
Equilibre las columnas con 0,5 mililitros de tampón de unión en frío y espere hasta que la solución haya fluido. Después de la incubación, agregue 400 microlitros de tampón de unión en frío a la perla y la suspensión celular. Cargue todo el volumen en la columna y recoja el efluente en un tubo de 15 mililitros.
Lave la columna cuatro veces con 0,5 mililitros de tampón de unión en frío y recoja el efluente total en el mismo tubo. Para el agotamiento de los fibroblastos no asociados al cáncer, filtre la suspensión celular con un colador de células de 70 micras humedecido con PBS y centrífume las células. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 80 microlitros de tampón PBE frío.
Agregue 20 microlitros de cóctel de agotamiento de fibroblastos no asociado al tumor. Mezclar bien e incubar la muestra a 4 grados centígrados durante 15 minutos en la oscuridad. Durante la incubación con cuentas, prepare columnas de agotamiento ferromagnético en un soporte magnético.
Equilibre las columnas con dos mililitros de tampón PBE frío y espere hasta que la solución haya fluido. Después de la incubación, agregue 400 microlitros de tampón a la suspensión de cuentas y células. Cargue todo el volumen en la columna y recoja el efluente en un tubo de 15 mililitros.
Lave la columna dos veces con dos mililitros de PBE. Recoger el efluente total en el mismo tubo y centrifugar el efluente. Para la selección positiva de fibroblastos asociados al cáncer, resuspenda el pellet en 80 microlitros de tampón frío de PBE.
Luego, a 20 microlitros de microblastos asociados a tumores, microperlas, e incubar las muestras a 4 grados centígrados durante 15 minutos en la oscuridad. Durante la incubación, prepare columnas de separación ferromagnética en un soporte magnético y equilibre con 0,5 mililitros de tampón frío de PBE. Después de la incubación, agregue 400 microlitros de PBE a la suspensión de cuentas y células.
Cargue todo el volumen en la columna y deje que las celdas sin etiquetar fluyan a través de un tubo de 15 mililitros. Lave la columna tres veces con 0,5 mililitros de tampón de PBE y recoja el efluente total en el mismo tubo. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.
Agregue un mililitro de PBE a la columna e inmediatamente empuje el émbolo hacia la columna para eliminar las celdas. Después de la centrifugación, vuelva a colocar el pellet celular en un volumen apropiado de DMEM y seme las células en una placa de cultivo de tejidos. Verifique la densidad celular bajo un microscopio y coloque la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran y crezcan.
La inyección de células de luciferasa 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra condujo al crecimiento de una masa tumoral detectable cinco días después de la implantación. Para encontrar una ventana de sacrificio que sea adecuada para el aislamiento de CAF, se buscó un compromiso óptimo entre un mayor tamaño del tumor y la imagen de bioluminiscencia, por un lado, y una ulceración tumoral emergente y necrosis, por otro lado. El día 20 se estableció como el punto de tiempo para optimizar la recuperación celular, después del proceso de aislamiento.
Se necesitaron dos pasajes más para aislar a la población de CAF, del panel de células viables recolectadas, el agotamiento de fibroblastos no asociados a tumores y el enriquecimiento de fibroblastos asociados a tumores. Las células CAF revelaron una gran morfología en forma de huso, típica de los fibroblastos, y fueron diferentes de las células tumorales 4T1. La expresión de FAP seguida a lo largo de cinco pasajes confirman que la cultura primaria caf mantuvo sus características originales.
Cuando no se mantuvo la duración y la temperatura de las incubaciones con microperlas, se encontraron clones con diferente morfología entre el cultivo aislado. Estas células contaminantes crecieron más rápido y prevalecieron sobre el cultivo primario de CAF. La unión de CAF con el nano fármaco funcionalizado Hfn-FAP de ferritina humana aumentó en una a una, y de una a cinco concentraciones de fragmentos de anticuerpos en tres veces, en comparación con la HFN desnuda.
Por el contrario, para las células tumorales 4T1, la HFN desnuda mostró una mayor unión que la HFN funcionalizada. Para aumentar la impureza de rendimiento del CAF aislado, mantenga los tampones fríos, respete el tiempo de incubación con perlas y extraiga hasta cuatro tumores por columna antes del paso final de enriquecimiento. Los CAF aislados se pueden utilizar para examinar varios nano fármacos candidatos en términos de unión, absorción y eficacia farmacológica antes de proceder con experimentos preclínicos in vivo.
El aislamiento de CAF nos permitió probar si las nanopartículas se pueden usar para atacar el microambiente tumoral. Allanando así el camino hacia nuevas terapias dirigidas que trabajan en sinergia con la quimioterapia.
