Nuestro protocolo supera la limitada ventana de imágenes de bioluminiscencia al incluir una etiqueta GFP que también facilita la detección y cuantificación de la micrometastasis mediante el análisis de PCR. Debido a que la etiqueta GFP elude la ventana limitada de adquisición de bioluminiscencia, se pueden tener imágenes de más sujetos sin la pérdida de señal y el potencial de resultados negativos falsos es limitado. Este estudio será útil para los investigadores para la evaluación de la eficacia terapéutica de los agentes contra el cáncer.
Esta metodología proporciona un modelo útil para los investigadores interesados en EMT, resistencia a los medicamentos y mecanismos de células madre cancerosas relacionados con el proceso metastásico, así como para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, frote la cuarta glándula mamaria izquierda con alcohol y use fórceps finos de dientes de rata para levantar ligeramente la cuarta glándula mamaria. Asegúrese de que la punta esté biselada, inserte una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 100 microlitros de la mezcla de matriz de membrana del sótano celular y retraiga ligeramente el émbolo para asegurarse de que la aguja no entre en contacto con ningún vaso sanguíneo.
Para obtener resultados comparativos, el lugar de inyección de células tumorales debe ser coherente entre todos los animales receptores. Si no entra sangre en la jeringa, inyecte lentamente todo el volumen de solución en la almohadilla de grasa mamaria. Una masa elevada redonda aparecerá debajo de la piel.
Espere de 10 a 15 segundos para que la matriz de membrana del sótano se endurezca antes de extraer la aguja y permita que el xenoinjerto crezca libremente sin interrupción durante siete a 10 días antes de realizar una medición del tamaño del tumor. A continuación, utilice pinzas para medir el tamaño del xenoinjerto en todos los ratones y determinar el volumen tumoral utilizando la ecuación como se indica. Antes de tomar imágenes de los animales del estudio, imagine tres ratones con rodamientos de tumores adicionales durante 40 minutos a intervalos de dos minutos utilizando los parámetros indicados para obtener la cinética de luciferina para el estudio.
Utilice la señal de bioluminiscencia medida de pico para definir la ventana de tiempo de adquisición de imagen óptima para todos los puntos de tiempo posteriores. Para realizar imágenes de metástasis, cubra el tumor primario con una manga cortada de un guante negro y coloque un ratón anestesiado en el escáner y luego imagine la señal de luciferina utilizando los mismos parámetros que acabamos de demostrar con el lado ventral del ratón frente a la cámara para imágenes de metástasis pulmonares y el lado dorsal del ratón frente a la cámara para obtener imágenes de metástasis cerebrales. Utilizando un escáner y un software de análisis de datos, dibuje una región de interés sobre el área de imagen para asegurarse de que todo el órgano de interés está cubierto para permitir la evaluación de la carga metastásica y cuantificar la producción de bioluminiscencia como el flujo total y fotones por segundo.
Inmediatamente después de la cuantificación de la señal de bioluminiscencia, cosechar el cerebro y el tejido pulmonar y enjuagar rápidamente los órganos en PBS para eliminar cualquier mancha superficial de sangre. Coloque los órganos en una placa de plástico negro de baja fluorescencia automática y transporte las muestras a un escáner de fluorescencia multiespectral equipado con capacidad de desmezcla espectral para la detección de GFP. Para adquirir imágenes GFP multiespectrales de los órganos extraídos, escanee los órganos de 500 a 720 nanómetros con un tamaño de paso de 10 nanómetros.
Para obtener el perfil de fluorescencia automática de tejidos, escanee los órganos extirpados de ratones de control no inyectados. Además, la imagen de los tejidos positivos de GFP, como el tumor primario, para adquirir perfil de GFP mixto de fluorescencia automática. Procesar estos espectros según el protocolo del fabricante para establecer una biblioteca espectral con perfiles de fluorescencia automática y GFP puros.
Después de confirmar la precisión de la biblioteca espectral y separar la señal GFP del fondo de fluorescencia automática de tejidos, utilice la misma biblioteca para desmezclar todas las imágenes en el estudio. Para la extracción de ADN después de congelarse, coloque todo el cerebro en un tubo homogeneizador de cinco mililitros que contenga dos mililitros de tampón de lysis de ADN y utilice un homogeneizador establecido en 50 para homogeneizar el tejido. Cuando el tejido se haya homogeneizado por completo, transfiera un mililitro del lisolato a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros libre y aísle el ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Añadir 500 microlitros de 100% etanol al aislado y mezclar la muestra por inversión. Después de tres minutos a temperatura ambiente, utilice una pipeta para transferir el precipitado de ADN similar a la lana a un nuevo tubo libre de dos mililitros DNAse y RNAse. Deje que la muestra se seque al aire durante un minuto antes de añadir un mililitro de 75% de etanol al tubo e invertir el tubo de tres a seis veces para lavar la muestra.
Deseche el etanol después de la última inversión antes de lavar el ADN dos veces más con etanol fresco por lavado como acaba de demostrar. Después del último lavado, seque al aire la muestra durante 10 segundos antes de disolver el ADN en 52 microlitros de hidróxido de sodio milimotora. Transfiera una alícuota de dos microlitros de ADN a un vial de espectrofotómetro y cuantifique la concentración de ADN en la muestra utilizando una relación de absorbancia entre A260 y 280 según la fórmula.
Ajuste la concentración de ADN de la muestra a 50 nanogramos por microlitro con hidróxido de sodio de ocho mililitros adicionales y diseñe el par de imprimación específico para la secuencia de GFP verde exógena internamente utilizando un portal web de diseño de imprimación de código abierto para la detección de PCR en tiempo real de la etiqueta GFP y las células metastásicas que han invadido y colonizado los sitios distales del tumor. A continuación, utilice un reactivo PCR rápido en tiempo real y una máquina pcR en tiempo real que admita un protocolo PCR rápido en tiempo real para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de la muestra. Para la detección de células de cáncer de mama metastásicas en el pulmón, utilice tijeras diseccionadas para abrir la cavidad torácica y corte más allá del corazón y el timo para exponer la tráquea.
Inserte una aguja de calibre 22 unida a una jeringa de 10 mililitros que contenga solución de Bouin en la tráquea y presione el émbolo hasta que los pulmones colapsados se hinchen con aproximadamente dos mililitros de la solución. Retire la jeringa y la aguja una vez que los pulmones se hayan inflado y transfiera todo el pulmón a un tubo de 15 mililitros que contenga solución fresca de Bouin. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces antes de dejar el tejido en remojo durante 24 horas a temperatura ambiente.
Al día siguiente, enjuague el pulmón con agua y coloque la muestra en un tubo de 70%etanol. Luego usa un microscopio diseccionado para contar el número de manchas blancas metastásicas y nódulos en las superficies de los pulmones. La medición del volumen tumoral por pinza es un método bien establecido para evaluar la eficacia del tratamiento.
Para obtener señales comparables entre los grupos de estudio, se debe realizar un estudio de cinética BLI pre-imágenes para determinar el mejor período de tiempo de diagnóstico por imágenes. Debido a la relación señal-fondo superior, todo el cuerpo in vivo BLI es bastante sensible en la detección de señales de metástasis de bajo nivel en comparación con el enfoque GFP. Sin embargo, debido a la naturaleza estable de la molécula GFP, los investigadores tienen tiempo suficiente para procesar la carcasa antes de capturar las señales de la GFP de los órganos diana en estudios de reportero dual.
Este ejemplo de la vida real demuestra cómo las mediciones del tamaño del tumor de la pinza pueden distorsionar la interpretación de los datos, ya que este xenoinjerto perdió la mayor parte del contenido viable de células tumorales mientras mantenía su gran masa y forma. La detección molecular por PCR en tiempo real también puede proporcionar evidencia convincente de metástasis cerebral en el modelo ortotópico de cáncer de mama utilizando la secuenciación exógena de ADN GFP, ya que la secuencia de ADN transfectivo GFP no existe naturalmente en humanos o roedores. El lugar de implantación debe estar relacionado fisiológica y anatómicamente con la neoplasia maligna del cáncer.
Tanto el gen tumoral como la expresión de proteínas se pueden evaluar en sitios primarios y distales, y las células metastásicas se pueden aislar para una caracterización adicional.
