El método Imaging the Right Mean Square Displacement es capaz de extraer simultáneamente tanto la estructura como las propiedades medias dinámicas de un objeto biológico objetivo en una muestra viva. Imaging the Right Mean Square Displacement, es un procedimiento rápido y robusto, sin necesidad de extraer trayectorias de un solo objeto y sin necesidad de un etiquetado complejo. Solo requiere una configuración óptica estándar y un objeto de interés etiquetado fluorescentemente.
El método allana el camino para el cribado cuantitativo a gran escala de las alteraciones estructurales y dinámicas que se encuentran a nivel de nanoestructuras subcelulares en varias afecciones patológicas, como el cáncer, la diabetes o los trastornos neurodegenerativos. Demostrando el procedimiento estará Fabio Azzarello, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el subcultivo de las células, comience lavando un plato tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros de células hela confluentes, dos veces, con PBS molar de 0.01.
Luego, agregue 1 mililitro de tripsina-EDTA al 0.05% e incube el plato a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células desprendidas en 9 mililitros de medio DMEM completo y recoja 10 mililitros de medio total con tripsina en el tubo de la centrífuga. Sembra aproximadamente 0.2 millones de células en cada plato de 35 milímetros por 10 milímetros con el volumen medio final de 1 mililitro, y luego incuba las células.
Dependiendo de la estructura subcelular de interés, se requiere un método de etiquetado específico, y una vez que la solución de etiquetado esté lista, lave las células dos veces con PBS molar 0.01. Después de reemplazar PBS con el medio que contiene el reactivo de colorante, incube el plato a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, según la recomendación del fabricante. Al final de la incubación, lave las células dos veces con un medio fresco antes del experimento.
Antes de realizar la adquisición de la serie de lapso de tiempo, encienda el sistema de control de la incubadora del microscopio y deje que el microscopio se equilibre a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente dos horas. Utilice un láser de argón de 488 nanómetros para la excitación de EGFP en células transfectadas y macropinesomas marcados con fluorescencia, y recoja la emisión de fluorescencia entre 500 y 600 nanómetros, utilizando un detector de tubo fotomultiplicador estándar. Utilice un láser de neón de helio de 543 nanómetros para excitar el tinte fluorescente y recoger la emisión entre 555 y 655 nanómetros.
Establezca el diámetro del agujero de detección en el tamaño de un Eri. Y, para cada adquisición, recoge una serie de 1000 fotogramas secuenciales. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 2 microsegundos por píxel para un tiempo de fotograma de 129 milisegundos.
Para inicializar correctamente los parámetros instrumentales para las adquisiciones, abra iMSD. M con el editor de texto del software. Establezca los parámetros escribiendo valores para N'as el número de fotogramas en la serie temporal, el tamaño de píxel en micrómetros y f'como la resolución temporal en segundos.
Además, establezca la entrada de corrección de fondo del filtro en cero, para procesar imágenes sin procesar, o una, para realizar una resta de fondo basada en umbrales. A continuación, establezca el umbral de peaje AV para la corrección en segundo plano. Si el valor del filtro se establece como uno, los píxeles con una intensidad inferior al valor umbral se establecerán como cero.
A continuación, establezca bit como el número entero que determina la intensidad del muestreo. Guarde y ejecute el iMSD editado. Archivo de script M.
Compruebe la ejecución del script en la ventana de comandos y, si se produce algún problema, se mostrará el mensaje de advertencia interrumpido. Después de la ejecución exitosa del script, importe la pila de imágenes y reste el fondo, si es necesario. Luego, calcule la función de correlación espacio-temporal, utilizando el método de Fourier.
Ajuste la función de correlación espacio-temporal con una función gaussiana 2D. A continuación, verifique la salida gráfica con la curva IMSD y las curvas de ajuste correspondientes, que se muestran en tres paneles separados para diferentes tipos de la ecuación de ajuste utilizada. Los valores de R-cuadrado se proporcionan en la leyenda del gráfico.
Luego, verifique la salida de texto. La adquisición de imágenes de lisosoma como orgánulo de prueba, se realizó en células vivas a la resolución temporal adecuada, y a una resolución temporal muy baja. La deformación artificiosa del lisosoma debido al movimiento del orgánulo, fue visible en la imagen de baja resolución.
El perfil de intensidad de la mancha se derivó utilizando una herramienta de línea en el software de análisis de imágenes. Luego, se realizó la estimación del diámetro del punto, trazando e interpolando la intensidad mediante una función gaussiana. La adquisición a alta velocidad, arrojó un tamaño de estructura promedio comparable cercano a la muestra fija.
En cambio, la adquisición a una velocidad lenta, aumentó el tamaño de la estructura, debido a la dinámica natural de la estructura durante la toma de imágenes. Las propiedades estructurales y dinámicas de los macropinesomas, fueron observadas durante el tráfico. Las observaciones revelaron una disminución en el tamaño promedio de los macropinosomas.
El aumento concomitante en el movimiento subdifusivo, se denotó por la disminución de los valores alfa. Para cada adquisición, se observó el aumento en el número de Macropinesomas con el tiempo. Por el contrario, mediciones similares realizadas en ISGs, sugirieron un comportamiento muy diferente de estos últimos orgánulos en comparación con los macropinesomas.
De hecho, los gránulos de insulina muestran propiedades estructurales o dinámicas sin cambios, promedio, lo que sugiere que fueron sondeados en un estado estacionario. El método se puede aplicar fácilmente en modo de color dual, si dos orgánulos subcelulares distintos están etiquetados de manera diferente. En este caso, el análisis de correlación cruzada destacará las posibles interacciones dinámicas de los dos objetos dentro de la célula.
