El ensayo de protección enzimática permite estudiar el alcance de la internalización de Staph aureus y su capacidad para sobrevivir dentro de las células adherentes, así como la eficacia del compuesto antimicrobiano. El ensayo de protección enzimática mejorado simplifica en gran medida el manejo técnico y permite recuperar bacterias internalizadas de células débilmente adherentes y células en suspensión. Demostrando el procedimiento estará Josselin Rigaill, médico y estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Dos días antes del ensayo de infección, sembra las células epiteliales A549 a una densidad de 2.0 veces 10 a la quinta célula por mililitro por pocillo de una placa de 24 pocillos e incuba las células durante 48 horas a 36 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono, hasta que alcancen el 100% de confluencia. El día del ensayo, retire y deseche el medio de cultivo gastado de los tres pocillos dedicados a contar las células A549, y agregue un mililitro de medio de infección completo que contenga cinco microgramos por mililitro de Hoechst 33342 y un microgramo por mililitro de yoduro de propidio. Incubar las células durante 30 minutos, luego, utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio, contar el número de células y calcular la viabilidad celular.
Para preparar la suspensión bacteriana, dispense 25 mililitros de medio de infección completo en un tubo y precalentarlo a 36 grados centígrados. A continuación, ajuste la suspensión de Staphylococcus aureus a una OD de 0.5 en un medio de infección completo utilizando un densímetro celular, luego prepare 20 mililitros de suspensión bacteriana para la inoculación celular diluyendo el cultivo en un medio de infección completo para lograr un MOI de uno de acuerdo con el número de células por pozo. A continuación, utilizando un plato espiral automático, determine la carga de Staphylococcus aureus de la suspensión bacteriana diluida que se utilizará para la etapa de inoculación celular e incube las placas de agar durante 18 a 24 horas a 36 grados centígrados.
Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular el MOI preciso para cada cepa probada. Antes de la inoculación celular, observe cada pocillo de la placa de 24 pocillos mediante microscopía de bajo aumento para asegurarse de que las células estén sanas y creciendo como se esperaba, luego retire y deseche el medio de cultivo celular gastado de la placa de 24 pocillos y agregue 500 microlitros de la suspensión bacteriana a cada pozo que contenga células 100% confluentes. Incubar las células durante dos horas a 36 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.
Para cuantificar las bacterias intracelulares con el ensayo de protección enzimática mejorada, prepare 4x tampón de lisis, 2% Tritón X-100, tripsina-EDTA y lisostafina en soluciones de trabajo como se menciona en el manuscrito de texto. A continuación, prepare 6.25 mililitros de medio de infección completo suplementado con lisostafina agregando seis mililitros de medio de infección completo a 250 microlitros de la solución de trabajo de lisostafina. Luego, agregue 250 microlitros del medio de infección completo complementado con lisostafina en cada pozo y agite suavemente la placa girando la placa a mano.
Para permitir que la lisostafina mate las bacterias extracelulares, incube las células durante una hora a 36 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%, luego inactive la lisostafina agregando 10 microlitros de proteinasa K a 20 microgramos por mililitro en cada pozo e incubando las células durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de lisis 4x para lisar las células por choque osmótico e incube las células durante 10 minutos a 36 grados centígrados. Después de la incubación, pipetear la célula lisar hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que las células estén completamente lisadas y homogeneizadas, luego use un plato espiral automático para determinar la carga de Staphylococcus aureus de cada pozo e incube las placas de agar durante 18 a 24 horas a 36 grados centígrados.
Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular la carga intracelular de Staphylococcus aureus de cada pozo. La internalización de dos cepas de Staphylococcus aureus por células epiteliales A549 se representa aquí. Utilizando el ensayo de protección enzimática que incluye lavados para eliminar la lisostafina, las cargas intracelulares medias fueron de 4,46 y 0,49 log cfu por mililitro para el tipo salvaje SF8300 y el mutante isogénico que carecía de los genes fnbA y B, respectivamente.
Utilizando el ensayo de protección enzimática mejorado que utiliza la proteinasa K para inactivar la lisostafina, las cargas fueron de 4,53 y 0,56 log ufc por mililitro, respectivamente. La actividad intracelular de la vancomicina, la rifampicina y la levofloxacina contra Staphylococcus aureus medida mediante un ensayo de protección enzimática se describe aquí. Las cargas intracelulares medias fueron de 4,57 log ufc por mililitro para el control, 4,51 para la vancomicina, 3,03 para la rifampicina y 2,91 para la levofloxacina.
Los lavados intensivos para eliminar la enzima tienden a separar las células más infectadas, lo que puede dar resultados inexactos y apoyar el uso del protocolo mejorado. El ensayo de protección enzimática mejorado facilita el estudio de la internalización de Staph aureus con organoides, y se puede adaptar fácilmente en el sistema de detección de alto contenido que se utiliza poniendo
