Nuestro protocolo describe cómo las técnicas como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas podrían usarse para confirmar si una proteína es una chaperona de histonas. Las técnicas cubiertas aquí, cuando se usa tándem, podrían aplicarse directamente para caracterizar a un chaperona putativo. El suyo podría ir de acuerdo con la técnica de biología estructural.
Las técnicas son aplicables al campo de la investigación de la cromatina. Sin embargo, los métodos individuales podrían aplicarse a cualquier otra proteína de interés, según sea necesario. Demostrando el procedimiento estará el Sr. Surajit Gandhi, un estudiante de doctorado de mi laboratorio, para el complicado ensayo desplegable;
Archana Samal, estudiante de doctorado, junto con el Sr. Ruchir C. Bobde para el experimento analítico de ultracentrifugación; el Sr. Somanath Baral, estudiante de doctorado; junto con el Sr. Ketul Saharan para el ensayo de superenrollamiento de plásmidos Primero, mezcle chaperonas de histonas de cinco micromolares con dímeros H2A / H2B de 20 micromolares en 300 microlitros de tampón de equilibrio. Centrifugar el complejo H2A/H2B de chaperona de histonas para eliminar cualquier precipitado.
Cargue la muestra en la columna de espín preequilibrada con búfer de equilibrio. Lave la columna con volúmenes de 100 columnas o cuatro mililitros de tampón de lavado para eliminar el exceso de dímero H2A / H2B. A continuación, mezcle el complejo H2A/H2B de chaperona de histonas con tetrámero H3/H4 de 20 a 60 micromolares.
Vuelva a lavar la columna con volúmenes de 100 columnas o cuatro mililitros de tampón de lavado para eliminar cualquier tetrámero H3/H4 no unido, luego eluya las muestras con tampón de elución. Sujete las muestras eluyentes al 18% SDS-PAGE. Luego, tiñe con Coomassie azul brillante R250 y visualiza el gel.
Purificar el dímero H2A/H2B, tetrámero H3/H4 en la chaperona de histonas individualmente con el tampón de diálisis mediante cromatografía analítica de exclusión de tamaño. Guarde el tampón de la ejecución para preparar diluciones adicionales más adelante y para usarlo como referencia en la celda AUC. Para muestras de AUC, mezclar las chaperonas purificadas con dímero o tetrámero en tubos separados hasta un volumen final de 450 microlitros utilizando el tampón de diálisis guardado para alcanzar un OD280 de 0.3 a 0.6.
Ensamble la celda con una pieza central de doble sector y ventanas de cuarzo provistas de una ultracentrífuga analítica con un detector de absorbancia. Llene 400 microlitros de la solución de muestra y 420 microlitros de tampón de diálisis en los sectores de referencia y muestra de la célula, respectivamente. Pese y equilibre con precisión las células y cárguelas en un rotor de titanio de cuatro orificios.
Alinee las celdas utilizando las marcas en la parte inferior de las celdas y el rotor. Cargue el rotor en la centrífuga, cierre la tapa y comience la carrera, lo que permite que se desarrolle un vacío y la temperatura se estabilice. Para el análisis de los datos, calcule la densidad y viscosidad de los componentes del tampón de proteínas y el volumen específico parcial basado en la composición de aminoácidos de la proteína utilizando el programa SEDNTERP.
Cargue los datos de la máquina AUC en el programa SEDFIT. Defina el menisco, la línea roja, la parte inferior de la celda, la línea azul y los límites del análisis de datos las líneas verdes. Elija Distribución continua de CS como modelo.
En la sección de parámetros, establezca la resolución máxima en 100. A continuación, establezca el coeficiente de sedimentación mínimo en cero y máximo en 10 a 15. Establezca la relación de fricción en 1.2 inicialmente y opte por flotar para derivar la relación de los datos.
Establezca la relación F en 0.68 para la regularización de un sigma. Establezca el volumen específico parcial, la densidad del tampón y la viscosidad obtenidos del SEDNTURP. Presione Ejecutar para permitir que el software resuelva la ecuación lam.
Pulse Ajustar para refinar. Seleccione Mostrar Mw máximo en CS en la función de visualización de la barra de herramientas principal para estimar masas moleculares. Mezcle el tetrámero H3/H4 de dos micromolares y el dímero H2A/H2B de cuatro micromolares con concentraciones crecientes de chaperona de histonas, que van de uno a seis micromolares, en un tampón de ensamblaje hasta un volumen final de 50 microlitros.
Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Simultáneamente, pretratar 500 nanogramos del plásmido PUC-19 superenrollado negativamente con un microgramo de enzima topoisomerasa I en el tampón de ensamblaje en un volumen final a 50 microlitros. A continuación, combine la solución premezclada que contiene tetrámero, dímero y chaperona de histonas con el ADN plasmático relajado.
Agregue 100 microlitros de amortiguador de parada 2X e incube para finalizar la reacción de ensamblaje desproteinizando el ADN plásmido. Agregue un volumen igual de fenol saturado de Tris en el tubo que contiene la mezcla de reacción y mezcle bien el contenido de la mezcla de reacción. Luego, centrifuga la muestra.
Recoger suavemente la fase acuosa superior que contiene el ADN plásmido con una micropipeta y mezclar un volumen igual de cloroformo. Vórtice la mezcla. A continuación, recoja la fase acuosa superior, agregue un volumen de 1/10 de acetato de sodio trimolar de pH 5.5 y 2.5 volúmenes de etanol helado.
Mezcle bien la solución invirtiendo el tubo de tres a cuatro veces. Centrifugar la muestra a 16, 200 g durante 10 minutos y desechar suavemente el sobrenadante. Mantenga los tubos abiertos a temperatura ambiente hasta que incluso pequeñas cantidades de etanol se evaporen, dejando el ADN plásmido precipitado en el tubo.
Los resultados analíticos de la SEC revelaron que el dominio de nucleoplasmina N-terminal recombinante de la proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana es un pentámero de 65 kilodaltons en solución. La muestra de nucleoplasmina sometida a tratamiento térmico mostró que el dominio es altamente termoestable. El dominio nucleoplasmina mostró estabilidad salina hasta dos molares de cloruro de sodio y estabilidad de urea hasta cuatro molares.
Un ensayo pull-down reveló que la interacción del dominio nucleoplasmina con el dímero H2A/H2B era estable hasta cloruro de sodio 0,4 molar, mientras que la asociación con H3/H4 era estable hasta 0,7 molares. La chaperona se une simultáneamente al dímero H2A/H2B y al tetrámero H3/H4, independientemente del orden en que se añadan a la chaperona, lo que indica sitios de interacción separados para los oligómeros. Las masas moleculares estimadas a través del AUC-SV revelan una estequiometría 1:1 del dominio de nucleoplasmina con los oligómeros de histonas.
En el ensayo de superenrollamiento de plásmidos, las chaperonas de histonas de plantas recombinantes AtNRP1 y AtNRP2 aumentaron la cantidad de plásmido superenrollado, lo que sugiere que podría depositar histonas en el ADN para formar nucleosomas, causando un súper enrollamiento del ADN. El ensayo de superenrollamiento de plásmidos necesita un cuidado especial y una posible optimización para la caracterización del ADN de histonas y chaperonas. La telemetría de caracterización isomérica se puede utilizar como seguimiento de los experimentos analíticos de exclusión de tamaño para confirmar la estabilidad de unión.
