Dada la complejidad de las reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación dentro de las células, es importante establecer ensayos in vitro con componentes purificados definidos. Esto ayuda a entender los mecanismos de ubiquitinación y desubiquitinación y también a determinar cómo las mutaciones asociadas con los genes que codifican las enzimas responsables de esta reacción pueden causar enfermedad humana. Podemos identificar los dominios y motivos en estos componentes que impulsan estas reacciones.
También podemos desarrollar ensayos de pantalla de alto rendimiento que se pueden utilizar para detectar inhibidores de moléculas pequeñas que se pueden desarrollar como terapias potenciales. Para comenzar la lelisis bacteriana, agregue el cóctel de PMSF y antiproteasa en el tampón de lelisis helada A.Add 25 millters del tampón de lelisis A en la botella que contiene bacterias pellet y resuspend el pellet. Transfiera el izado que contiene bacterias en un tubo para la sonicación.
Utilice un sonicador de sonda para sonicar el izado a una amplitud de salida del 70% durante 30 segundos, de cuatro a cinco veces. Luego centrifugar a 21.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de incubar el licato de bacterias con cuentas GSH durante cinco horas según el manuscrito, transfiera las cuentas junto con 10 milivarios de tampón en una columna de cromatografía vacía.
A continuación, agregue 1,5 milímetros de tampón A que contenga 25 glutationes mililares en la columna y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 mililitros. Repita el procedimiento de elución cuatro veces con tampón fresco A un tratamiento continua de las fracciones eluidas según el manuscrito. Para empezar, resuspender los gránulos de la bacteria His-BAP1 y MBP-DEUBAD en 25 milivarios de tólisis helada B.Mix 25 milltadores de cada relación e incubar en hielo durante 15 minutos.
Sonicar y luego centrifugar el izado a 21.000 veces g durante 20 minutos. Después de la centrifugación de izado, filtre el analizado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 micrómetros en un frasco y mezcle con las perlas de níquel NTA. Incubar a cuatro grados centígrados con temblor durante cinco horas.
Después de eso, gira las cuentas a 25.000 veces g durante tres minutos. Utilice una pipeta para guardar el sobrenadante en un tubo de 50 mililitros a medida que el flujo a través. Lavar las cuentas con cinco milímetros de tampón B, que contienen 20 imidazol mililolar, seis veces con centrífuga de tres minutos.
Después del último lavado, transfiera las perlas con 10 milímetros de tampón B a una columna de cromatografía vacía y agregue un mililitro de tampón B que contenga 200 imidazol mililolar. Recoger la elución por gravedad en microtubos de 1,5 mililitros que contienen TDT y EDTA. Repita el procedimiento de elución cuatro veces y aduponga las fracciones eluidas deseadas en un tubo de 15 mililitros.
Agregue el búfer C para diluir el complejo eluido tres veces. Luego transfiera la elución diluida a las cuentas de amilosa preparadas en tubos e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Por la mañana, centrifugar los tubos a 2.500 veces g durante tres minutos y mantener el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros como flujo a través.
Lave las cuentas unidas a proteínas con cinco milivarios de tampón C durante cinco a seis veces. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón D al complejo su-BAP1/MBP-DEUBAD purificado en las perlas de agarosa de amilosa para hacer una solución de perlas del 50%. Transfiera 20 microlitros de la solución de 50% de perlas a un tubo de microcentrífuga y agregue 20 microlitros de dos veces lansilla de muestra de Laemmli para el análisis azul SDS-PAGE y Coomassie.
Almacene la solución de perlas restante en menos 80 grados Celsius para uso futuro. Después de cultivar las células HEK293T, vajilla 12 millones de células en 20 milímetros de medios completos en un plato de cultivo de 15 centímetros, un día antes de la transfección. Después de un día, bajo la capucha de cultivo celular, aspirar medios y suministrar 12 milivales de medios libres de suero.
Transfectar las células con 21 microgramos de pCDNA flat-H2A usando 63 microlitros de PEI a un miligramo por mililitro. Después de 12 horas, cambie a medio completo. Después de cosechar las células según el manuscrito, resuspendir el pellet celular en unos 10 volúmenes de tampón E que contiene NEM para inhibir las deubiquitinas e incubar en hielo durante 20 minutos.
Después de la centrifugación a 3.000 g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Lavar el pellet de cromatina dos veces con 10 volúmenes de tampón E primero y luego lavar dos veces con tampón F.Resuspend la cromatina en cinco milivarios de tampón F y tratar el pellet con nucleasa microcócica a la concentración de tres unidades por mililitro durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, transfiera una alícuota de 40 microlitros de la mezcla a un tubo de 1,5 mililitros para el análisis de fragmentos de ADN nucleosómico.
Añadir 40 microlitros de fenol-cloroformo y 20 microlitros de seis veces tampón de carga de ADN. Vórtice y girar a 18.000 veces g durante dos minutos. A continuación, transfiera 15 microlitros de la fase acuosa en un gel de 2% de agarosa para cargar el ADN.
Después de detener la reacción y la centrifugación según el manuscrito, incubar la fracción de cromatina soluble con cuentas de resina anti-bandera en un tubo de 15 mililitros durante la noche a cuatro grados centígrados con temblor. Lave las cuentas seis veces con el tampón G.Transfiera las perlas con cinco milivarios de tampón G en una columna de cromatografía vacía. Diluir los nucleosomas ligados del cordón con 260 microlitros de tampón G que contienen 200 microgramos por mililitro de péptido de elución de bandera y de uno a cinco Tris molares a pH ocho.
Eluir los nucleosomas tres veces, una hora en la sala fría. Para realizar el ensayo de ubiquitinación, primero agregue un microgramo de los nucleosomas purificados en 40 microlitros de tampón H.Después de eso, agregue una mezcla de solución enzimática que contenga 250 nanogramos de UBE1, 672 nanogramos de enzimas conjugantes UB y E2 UB y un microgramo de complejo de BMI1-RING1B E3 ubiquizolasa en el tubo. Incubar la reacción durante tres horas a 37 grados centígrados con temblores ocasionales.
Detenga la reacción añadiendo 40 microlitros de dos veces la tampón de muestra de Laemmli y analice la histona H2AK119 ubiquitinación por hinchazón occidental. Para realizar el ensayo de deubiquitinación in vitro resuspendir los nucleosomas purificados en 40 microlitros de tampón I y un microgramo de bacterias purificaron las cuentas His-BAP1/MBP-DEUBAD. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres horas para llevar a cabo la reacción de deubiquitinación con temblores ocasionales.
A continuación, detenga la reacción añadiendo 40 microlitros de dos veces el tampón de Laemmli y analice por inmunoblotting. En este experimento, la tinción azul de Coomassie para una purificación típica del complejo GST-BM1-RING1B utilizando cuentas de afinidad GST, muestra que las bandas migran con un peso molar esperado alrededor de 45 kilodaltones y 13 kilodaltones respectivamente. Del mismo modo, la purificación del complejo His-BAP1 MBP-DEUBAD también dio lugar a preparaciones relativamente altas y homogéneas con bandas de alrededor de 90 kilodaltones y 55 kilodaltones respectivamente.
Por otro lado, la fracción nucleosomal purificada está compuesta esencialmente por una banda de 147 pares base que indica la presencia de fracción mononucleosomal altamente enriquecida. La tinción azul coomassie de nucleosomas purificados muestra un patrón de banda típico de las cuatro subunidades histonas con cantidades estequiométricas. La ubiquitinación de la histona H2A con el complejo BMI1-RING1B muestra un aumento dependiente del tiempo de la forma ubiquitinada de la proteína, mientras que los niveles de la forma no modificada se reducen de forma concomitante.
La reacción de ubiquitinación es total ya que prácticamente todas las proteínas H2A se transforman en H2A K119ub. Por otro lado, el ensayo de desubiquitinación se llevó a cabo nucleosomas nativos. Tras la incubación de estos nucleosomas con BAP1-DEUBAD se observó una reducción dependiente del tiempo de la señal H2A K119ub.
El éxito de las reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación depende de la forma en que se purifica la proteína. Necesitamos un buen rendimiento y el uso de tampones para la resuspensión proteica y la purificación debe ser compatible con reacciones bioquímicas. Cuando este ensayo de ubiquitinación y desubiquitinación está bien establecido podemos probar el efecto activadores e inhibidores, así como el impacto de las mutaciones genéticas asociadas a la enfermedad.
Este método ha sido establecido por la contribución de varios laboratorios y son muy útiles para entender los mecanismos de ubiquitinación y desubiquitinación. Varios productos químicos son peligrosos y necesitan ser manipulados en el capó. Esto incluye fenol-cloroformo, ácidos, bases, y agentes reductores.
