Este protocolo proporciona pautas paso a paso para una ruta reproducible de acceso a regiones de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Esta técnica aumenta la precisión cuando se administran pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior. Esta técnica ha sido y puede ser aplicada a otros modelos animales.
Veronique VanderHorst, profesora asociada de neurología e investigadora principal del Laboratorio VanderHorst, demostrará este procedimiento. Asegúrese de que el flujo de oxígeno se dirija al cono de la nariz. Mueva el ratón al marco estereotáxico y coloque la nariz en un cono nasal flexible.
Coloque el ratón en el marco estereotáxico utilizando únicamente las barras para los oídos. Coloque lubricante en los ojos. Anteroflex la cabeza del ratón a un ángulo de 90 grados guiando manualmente la nariz.
Para asegurar esta posición, coloque una barrera de plástico entre los pilares de la barra auditiva del adaptador del mouse paralelo a los pilares con la parte plana del cráneo que sirve como referencia. Coloque la almohadilla térmica debajo del mouse y asegúrese de que el cuello y el resto del cuerpo estén colocados paralelos a la mesa elevando el cuerpo con una caja pequeña. Coloque una cortina debajo del cuerpo.
Inyecte una dosis única de cuatro miligramos por kilogramo Meloxicam de liberación lenta por vía subcutánea a un volumen de dos microlitros por gramo de peso corporal. Limpie el sitio de la incisión quirúrgica primero con una almohadilla de preparación de alcohol al 70%, luego con una almohadilla de preparación de betaína y luego nuevamente con una almohadilla de preparación de alcohol y déjela secar. Desinfecte las manos y póngase guantes estériles, luego coloque una cortina en el sitio quirúrgico.
Asegúrese de que el ratón esté anestesiado adecuadamente pellizcando los dedos de los pies o revisando el reflejo corneal. Reducir el isoflurano para mantener los niveles en 2.0. Haga una incisión de uno a 1,2 centímetros con una cuchilla quirúrgica de 10 desde el borde del hueso occipital hacia los hombros en un movimiento suave.
Haga cuidadosamente una incisión en el rafe de la línea media del músculo trapecio, exponiendo los músculos pareados de longus capitis. Coloque ambos ganchos retractores entre los músculos de longus capitis emparejados, uno orientado a la izquierda y el otro a la derecha. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los vientres izquierdo y derecho del músculo longus capitis emparejado, comenzando desde el occipucio donde la línea media es fácilmente visible.
Guíe las pinzas romas a través del hueso del occipucio en la línea media hasta donde se encuentra con la duramadre cisternal y luego continúe a través de la duramadre hasta el atlas. Reposicione los retractores y ajuste la tensión reposicionando los hemostáticos. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los músculos más en la línea media para obtener una buena vista del tronco encefálico y el cerebelo.
Repita el procedimiento anterior según sea necesario hasta que el cerebelo y el tronco encefálico aparezcan debajo de la duramadre. Usando fórceps de laminectomía contundentes, limpie la duramadre de las pequeñas hebras de tejido conectivo moviendo las pinzas desde la línea media en dirección lateral hasta que haya una vista clara del tronco encefálico, creando más espacio lateral. Vea la superficie dorsal del tronco encefálico con puntos de referencia detallados a través de la duramadre abierta.
Use las pinzas en ángulo para agarrar la duramadre que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas, luego use las tijeras de resorte para hacer una pequeña abertura de aproximadamente 0.5 a 1.5 milímetros en la duramadre. Una vez que se abre la duramadre, drene el exceso de líquido cefalorraquídeo con una punta Q estéril. El obex, el punto donde el canal central se abre en el cuarto ventrículo, es el punto cero estándar anterior-posterior y mediolateral.
Coloque la pipeta o jeringa en el objetivo con el brazo estereotáxico. Bajar el brazo de la dorsal sobre la superficie dorsal que se forma a partir del punto cero dorsoventral. Luego baje la pipeta sobre el tronco encefálico e inyecte la solución.
Deje la aguja en su lugar durante uno a cinco minutos después de la inyección para evitar una pista de aguja cuando use volúmenes entre tres y 50 nanolitros. Luego levante la pipeta o jeringa con el brazo estereotáxico y repita esto para múltiples objetivos. Retire los ganchos con cuidado del campo quirúrgico.
Los músculos pareados del longus capitis volverán a caer en una posición neutral cubriendo completamente la cisterna magna. No cierre el músculo trapecio y la duramadre en la línea media, ya que son demasiado frágiles para sostener las suturas. Cierre la piel con 3 suturas de nylon o polipropileno.
El enfoque cisterna magna permite apuntar al tronco encefálico caudal y a las estructuras del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. En ratones, estructuras como el núcleo hipogloso, el grupo respiratorio ventral y la formación reticular adyacente en el tronco encefálico caudal se han dirigido rutinariamente utilizando el enfoque cisterna magna como se ilustra aquí para el núcleo hipogloso y la médula ventromedial. Para determinar la precisión del enfoque cisterna magna versus el enfoque estándar, se midió la distancia entre los sitios objetivo previstos y reales en los planos anteroposterior, mediolateral y dorsoventral para las regiones ventral y dorsal.
Los resultados muestran errores significativamente menores en los planos anteroposterior, mediolateral y dorsoventral en comparación con el enfoque estándar, destacando la mayor precisión del enfoque cisterna magna para estos objetivos. Al intentar este protocolo, es fundamental asegurarse de que la anteroflexión de la cabeza y la elevación del cuerpo se realicen como se describe. A continuación, es importante reconocer los puntos de referencia clave antes de manipular el músculo o la duramadre.
Si estos puntos de referencia no se reconocen o si se pierden, será un desafío mantenerse orientado y ejecutar el procedimiento según lo previsto. Esta técnica ayudó a abordar cuestiones conceptuales relacionadas con la organización anatómica funcional dentro del tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior.
