Las imágenes de calcio in vivo de miniscope permiten a los investigadores examinar la actividad coordinada espacial y temporalmente de cientos de neuronas en estructuras cerebrales profundas de animales que se comportan libremente. Las imágenes de calcio in vivo de miniscopio ofrecen muchas ventajas, incluida la capacidad de realizar grabaciones que son específicas del tipo de célula, a gran escala y longitudinales. Nuestro protocolo de cirugía para inyección viral e implantación de lentes GRIN es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de fotón único y dos fotones para el cerebro profundo imágenes de calcio in vivo.
Demostrando el procedimiento estará Rashmi Thapa, un estudiante graduado de mi laboratorio. Después de desinfectar el área quirúrgica afeitada de un ratón anestesiado, use un bisturí para hacer una incisión de dos centímetros a través de la piel a lo largo de la línea media para exponer la lambda y el bregma del cráneo. Después de localizar la rebaba de taladro dental de 0,5 milímetros a una posición de 1,94 milímetros posterior anterior y lateral medial de 0,5 milímetros desde el bregma, comience a perforar a través del cráneo.
A continuación, cargue el virus en la jeringa de microlitro utilizando el panel de control de la microbomba y retire 500 nanolitros de burbuja de aire seguidos de 800 nanolitros del virus a una velocidad de flujo de 50 nanolitros por segundo. Desplácese lentamente por la aguja hacia el tejido cerebral hasta la coordenada Z objetivo del ventral dorsal de 1,75 milímetros y luego muévalo ligeramente hasta la coordenada Z del ventral dorsal de 1,65 milímetros. En el panel de control, configure la microbomba para inyectar 500 nanolitros del virus a una velocidad de flujo de 50 nanolitros por minuto antes de presionar el botón Ejecutar para inyectar el virus.
Cuando termine la inyección, alinee los bordes de la piel y cierre cuidadosamente la incisión con una sutura 4-0. Aplique ungüento antibiótico en el área cosida para prevenir la infección. Para implantar el índice de gradiente o lente GRIN, extirpa un área triangular de la piel de 1,5 centímetros de altura y 1,5 centímetros de base desde el lado anterior entre los ojos hasta el lado posterior detrás de la lambda usando tijeras finas.
Después de limpiar y secar bien el cráneo, aplique cianoacrilato en los bordes de la piel y adhiera la piel al cráneo. Después de cinco minutos cuando el cianoacrilato se seque, localice una rebaba de taladro dental de 1,2 milímetros de diámetro a una posición de 1,94 milímetros posterior anterior, medial lateral de 0,8 milímetros de la bregma. Perfore a través del cráneo, seguido de quitar la duramadre con una punta de aguja de calibre 30.
Limpie todas las piezas de escombros óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 grados. A continuación, conecte una aguja de extremo romo pulido manualmente de calibre 27 al soporte de la aguja acoplado a un brazo robótico inclinado con un ángulo de 10 grados y conecte el otro extremo del soporte de la aguja al sistema de vacío de la casa. Ubique la punta de la aguja con solo tocar el bregma antes de hacer clic en el botón Bregma para establecer la coordenada Z de bregma en cero.
Establezca el valor de la entrada X en 0.8, ingrese el valor Y en 1.94, ingrese el valor Z en 1.0 y haga clic en el botón Buscar para mover la aguja a la parte superior del orificio perforado en el cráneo. Centra la punta de la aguja en el orificio perforado y llévala a la posición Z cero. Encienda la aspiradora y comience a enjuagar el área expuesta del cerebro con líquido cefalorraquídeo artificial, o ACSF, a través de un sistema de tubos controlados por gravedad conectado a una aguja de calibre 30 con una punta doblada.
El ACSF se burbujea continuamente con una mezcla de gases de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono mientras se filtra a través de un filtro de 0,2 micras. Utilizando el software AutoStereota, la aspiración del tejido cerebral se completará en cuatro rondas. Para la primera ronda de aspiración, asegúrese de que el valor Z muestre cero.
Luego, en la sesión zStep, haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 0,2 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4.
En la sesión de modo, establezca el tamaño de la aguja calibre 27 y 1.2. Establecer Dims 0.9. Todos los demás valores serán predeterminados.
Para iniciar la aspiración, haga clic secuencialmente en los botones NotSet, KeepZero e Inicio. La primera ronda de aspiración genera un bolsillo de columna con 0,8 milímetros de profundidad y 1 milímetro de diámetro. En la tercera ronda de aspiración, haga clic y compruebe la primera fila de la sesión zStep y establezca los valores de la primera fila en 1,8 y 1.
En la sesión de modo, establezca el tamaño de la aguja calibre 27 y 2.2. Comienza la aspiración manteniendo otros valores iguales a los de la ronda anterior. Después de la tercera ronda de aspiración, la profundidad del bolsillo de la columna es de 1,8 milímetros.
La última ronda de aspiración es limpiar la sangre acumulada en la parte inferior del bolsillo. Establezca los valores de la primera fila en 1.6 y 1 en la sesión zStep y establezca el calibre de aguja 27 y 2.2 y Dims 0.6 en la sesión de modo antes de iniciar la aspiración. Una vez que el bolsillo esté libre de sangre, detenga el vacío, detenga la irrigación de ACSF y suba la aguja 2 milímetros en coordenada Z y 0,5 milímetros antes del centro.
Coloque la lente GRIN estéril de 1 milímetro en el bolsillo del tejido cerebral. A continuación, aplique la agarosa derretida en el espacio entre la lente GRIN y el tejido cerebral con la ayuda de una espátula. Después de que la agarosa forme un gel, retire el exceso de agarosa con una micro cuchilla.
Mezcle el polvo de cemento dental y el líquido catalizador en un pozo de mezcla preenfriado y aplique una capa de cemento de resina adhesiva autocurable en el cráneo, comenzando rodeando la lente GRIN y luego cubriendo todo el cráneo expuesto. En un pozo de plástico limpio, mezcle el polvo de cemento dental y el carbón negro con líquido para aplicar una capa delgada de la mezcla sobre la primera capa de cemento dental. Deja que se endurezca durante cinco minutos.
Conecte el Miniscope al cable y encienda el software desarrollado a medida NuView. En NuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo. Para detener la transmisión en vivo, haga clic en el botón Detener.
A continuación, coloque el Miniscope en un brazo de sujeción Miniscope personalizado. Con la ayuda de controladores motorizados, ubique el Miniscope justo encima de la lente GRIN expuesta, haciéndola paralela a la superficie de la lente. Baje lentamente el Miniscope hacia la lente GRIN y ajuste su posición Z hasta que se encuentre el mejor plano de enfoque.
Aplique la primera capa de cemento dental alrededor de la base del Miniscope sin alterar la posición del Miniscope. Después de endurecer el cemento, retire suavemente el brazo de sujeción para que el Miniscope pueda pararse por sí solo en la cabeza del mouse. Aplique una segunda capa de cemento dental alrededor de la base para llenar todos los huecos, asegurándose de que no haya fugas de luz LED de los huecos.
Deja que el cemento dental se endurezca. Después de anestesiar brevemente el ratón con isoflurano, afloje el tornillo de bloqueo en la base con un pequeño destornillador antes de quitar la tapa protectora y limpie la superficie de la lente GRIN con un hisopo de algodón empapado en acetona. Conecte el Miniscope al cable e inicie el software NuView para comenzar a identificar el mejor plano focal ajustando la posición del Miniscope en relación con la base apretando o aflojando ligeramente con la ayuda de pinzas romas.
Una vez que se determine el mejor plano focal, apriete el tornillo de bloqueo antes de desconectar el cable y colocar el mouse de nuevo en su jaula de inicio. Encienda el software de la cámara de comportamiento para ver el campo de comportamiento del mouse a través de una función de transmisión en vivo. Ajuste manualmente el enfoque de la cámara superior.
Seleccione Trigger Strobe y marque activar/desactivar disparador, seguido de hacer clic en el botón Grabar. A continuación, utilice Examinar para seleccionar una ubicación donde se guardarán las grabaciones de comportamiento. Seleccione el formato de imagen deseado.
Acerque el ratón a la arena y conecte el Miniscope al cable conectado al sistema de adquisición de datos. Luego coloque el mouse en el centro de la arena. En el software de la cámara de comportamiento, haga clic en Iniciar grabación.
En NuView, verifique LED1, haga clic en Capturar y luego active los botones para comenzar a grabar. Esto permite grabaciones simultáneas de imágenes de calcio y comportamiento del ratón. Presione Detener después de 3, 000 cuadros y guarde los archivos.
Cuando finalice la grabación, anestesia brevemente el ratón con isoflurano, separa el Miniscope de la base y coloca la tapa protectora sobre la base antes de volver a colocar el ratón en su jaula de origen. El mapa celular de las imágenes de calcio in vivo subóptimos contenía algunas neuronas activas, mientras que el de las imágenes exitosas incluía varios cientos de neuronas activas en el área enfocada. En el ejemplo típico de una imagen de calcio in vivo sin éxito, se observó que la región era oscura y contenía menos de cinco neuronas activas, o la región era brillante pero no tenía neuronas activas.
En el análisis representativo, se muestra el mapa celular de fluorescencia de proyección máxima y los transitorios de calcio de un registro sucesivo de imágenes de calcio in vivo. La evaluación postmortem para la expresión de GCaMP6f y la implantación de lente GRIN en el PFC medial de un ratón experimental indicó que GCaMP6f se expresó y la lente GRIN se implantó con precisión en la región cerebral deseada. Para obtener una buena imagen de calcio, es necesario asegurarse de que el sangrado se haya detenido por completo y que el campo esté libre de coágulos de sangre antes de implantar la lente GRIN.
Esta técnica se puede utilizar para estudiar los cambios en el circuito neuronal en el modelo de ratón de diferentes trastornos cerebrales humanos y probar si un candidato a fármaco puede normalizar los circuitos alterados.
