Los mecanismos de agregación de proteínas se han investigado hasta ahora principalmente in vitro. Con nuestro protocolo podemos hacer estudios cuantitativos similares en el organismo modelo C.elegans. La principal ventaja de nuestro método es la cuantificación imparcial de los números de inclusión.
Y al ajustar estos datos de alta calidad a los modelos matemáticos, podemos obtener información sobre el mecanismo de agregación. La agregación de proteínas ocurre en muchas enfermedades, incluyendo el Alzheimer y la enfermedad de Huntington. Comprender el mecanismo molecular de la agregación de proteínas in vivo es crucial para desarrollar nuevas terapias.
Comience colocando 10 nematodos adultos en una placa NGM sembrada de 6 cm con una púa de gusano de platino para realizar una puesta de huevo sincronizada. Deje que los adultos pongan huevos durante aproximadamente dos horas a 20 ° C antes de retirarlos del plato. Coloque las placas con huevos en la incubadora a 20 C.Monitoree el desarrollo de los animales hasta que alcancen la edad adulta aproximadamente el tercer día después de la puesta de huevos.
Prepare la placa de 384 pocillos llenando el número requerido de pocillos con 100 L de tampón M9 complementado con azida de sodio de 25 mM como anestésico. Llene un pozo por cepa para ser fotografiado. Para cada cepa, transfiera 20 animales a un pozo usando una púa de gusano de platino.
Cubra la placa con la tapa para la evaporación preventiva y tome una imagen de la placa dentro de una hora después de la preparación. Encienda el instrumento y abra el software. Haga clic en el botón Reproducir junto a Descargar placas de pozo y coloque la placa de 384 pocillos en el microscopio.
En Lista de acciones y adquisición de fluorescencia 3D, haga clic en Probar y seleccione el pozo que contiene gusanos. Establezca Procesamiento de imágenes en Ninguno. Y haga clic en el botón Reproducir para determinar la distancia de desplazamiento óptima a la que los gusanos están centrados correctamente.
Establezca la distancia ascendente en 50 m, la distancia descendente en 50 m y el intervalo de corte en 2 m para capturar todo el grosor de los animales en la pila z. Vuelva a establecer Procesamiento de imágenes en Máximo. Seleccione los pozos que se van a visualizar en Configuración de escaneo de placas de pozos.
Y luego seleccione Azulejo y Adquirir pozo entero. Guarde la configuración de medición. Y haga clic en Iniciar medición para iniciar el experimento.
Abra CellProfiler y arrastre la canalización a la ventana Colocar un archivo de canalización aquí. Haga clic en Sí para cargar el proyecto. A continuación, arrastre las imágenes cosidas a la ventana Colocar archivos y carpeta aquí.
Haga clic en el módulo de entrada de metadatos. Ajuste la expresión regular para extraer del nombre del archivo de acuerdo con los nombres de las imágenes cosidas. Haga clic en el módulo de entrada NamesAndTypes y ajuste Seleccionar los criterios de regla para que coincidan con los canales de los nombres de archivo.
Luego, haga clic en Configuración de salida para seleccionar una carpeta para guardar la salida de CellProfiler. Haga clic en Iniciar modo de prueba para comprobar la configuración de la canalización utilizando el primer conjunto de datos de imágenes. Haga clic en Paso para ejecutar a través de la tubería, un módulo a la vez.
Para ajustar los contornos del gusano, haga clic en Mostrar ayuda en el módulo EditObjectsManually para ver las instrucciones. Corrija los contornos. Y luego haga clic en Listo para continuar ejecutando la canalización.
Haga clic en Salir del modo de prueba y analizar imágenes. Abra la carpeta de salida para ver los archivos de salida. Y abra las imágenes con el nombre de archivo original seguido de contornos para verificar si los gusanos y las inclusiones se superpusieron correctamente.
Para comenzar a usar AmyloFit, asigne un nombre al proyecto y haga clic en Crear proyecto. Haga clic en Abrir para abrirlo. Y cree una sesión dándole un nombre y haciendo clic en Crear y cargar sesión.
Haga clic en Agregar datos y cargue el archivo que contiene el número promedio de inclusiones por animal, siguiendo los requisitos de formato de datos que se muestran en el panel izquierdo. Luego, haga clic en Cargar nuevos datos. Establezca Número de puntos para promediar para el desplazamiento de punto cero en 0, y establezca Número de puntos para promediar para la meseta en 0 para omitir los pasos de preprocesamiento, que no son necesarios para los datos de recuento de inclusión.
Luego, haga clic en Enviar. Repita este paso para cada concentración de proteína. Seleccione Personalizado en el panel Modelo.
Introduzca la ecuación para la nucleación independiente en el cuadro Ecuación. Y haga clic en Cargar modelo. Para Ncells, establezca el tipo de parámetro en Constante global y establezca Valor en 95, correspondiente al número de células musculares de la pared corporal.
Establezca los tipos de parámetros en Ajuste global para Kcell y n. Y a Constante para m. Introduzca los valores de m para las diferentes cepas en el panel izquierdo.
Deje sin cambios el número de saltos de cuenca y haga clic en Ajustar en el panel Conexión. Finalmente, extraiga el ajuste haciendo clic en Descargar datos y Ajustar. Los números de inclusión fueron monitoreados en cuatro cepas de C.elegans que expresaban diferentes concentraciones de Q40.
El modelo de nucleación independiente describe bien la cinética de agregación. El ajuste produjo un orden de reacción de 2.1 y una tasa de nucleación de 0.38 moléculas por día por célula a una concentración de proteína intracelular de 1 mM. Dos réplicas biológicas independientes en un estudio anterior mostraron valores estrechamente correspondientes para el orden de reacción y la tasa de nucleación.
Una cosa que debe tenerse en cuenta es que necesita conjuntos de datos de alta calidad para múltiples concentraciones de proteínas para obtener ajustes confiables. Este método se puede utilizar para encontrar formas de interferir con la agregación de proteínas en un organismo vivo, como derribos genéticos o tratamientos de moléculas pequeñas.
