Nuestro protocolo investiga la diversidad de levaduras y mohos en el suelo utilizando muestras de suelo obtenidas de diferentes regiones climáticas. Esto proporciona información sobre la diversidad ambiental de levaduras y ayuda a rastrear especies patógenas. El protocolo ofrece un método rentable y rápido de cosechar levaduras y moho del suelo.
Las muestras de suelo se pueden procesar completamente para obtener aislamientos en tan solo siete días. Una configuración experimental bien organizada, como etiquetar los tubos de cultivo y preparar los medios con un día de anticipación es la clave para evitar sentirse abrumado durante el experimento. Comience con la preparación de un conjunto de tubos de cultivo estériles de 13 mililitros.
Al etiquetarlos con id de muestra de suelo, luego use una pipeta serológica para agregar cinco mililitros de caldo de extracto de levadura-peptona-dextrosa suplementado con cloranfenicol y benomilo en cada tubo. Dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, transfiera aproximadamente 0,1 gramos de suelo al tubo de cultivo apropiado utilizando un aplicador de punta plana de madera estéril. Cubra el tubo de forma segura hasta la primera parada, evitando derrames y permitiendo el intercambio de aire durante la incubación.
A continuación, incube los tubos de cultivo en un tambor de rodillos durante 24 horas a una temperatura que se considere óptima para maximizar el crecimiento de la levadura. Luego etiquete las placas de agar peptona-dextrosa de extracto de levadura suplementadas con cloranfenicol y benomilo con la identificación de la muestra de suelo antes de transferir el sobrenadante al medio sólido. Retire los tubos de cultivo del tambor de rodillos.
Luego, dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, vórtice brevemente el tubo para dibujar las partículas del suelo y las células que pueden haberse asentado en la parte inferior de nuevo en suspensión. A continuación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa usando una micropipeta. Use un esparcidor de células reutilizable estéril para esparcir el líquido de manera completa y uniforme sobre la superficie del agar.
Después de permitir un tiempo de incubación suficiente de dos a tres días, inspeccione las placas para detectar cualquier crecimiento de levadura dentro de un gabinete de bioseguridad para detectar organismos de nivel dos. Busque levaduras cremosas, redondas y mates que puedan distinguirse fácilmente de las colonias bacterianas y de moho. Seleccione una colonia similar a la levadura de cada placa utilizando barras aplicadoras estériles de madera con punta lisa.
Transfiera cada colonia seleccionada a un extracto de levadura fresca placas de agar peptona-dextro suplementadas con cloranfenicol y benomilo y raya para colonias individuales. Realice tres rayas separadas y use una nueva barra aplicadora para cada raya. A continuación, use células frescas desarrolladas en una placa para realizar una reacción en cadena de la colonia polimerasa.
Utilice los espaciadores internos transcritos ITS1 e ITS4 para amplificar el gen de codificación de barras fúngicas. Comparar la secuencia del espaciador transcrito interno obtenido de las cepas de levadura, dos secuencias depositadas en bases de datos públicas, como el Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank y UNITE para establecer la identidad de la especie. Agregue tierra a los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de caldo de dextrosa Sabouraud e incube a 50 grados centígrados durante dos a cuatro días.
Para transferir el micelio del caldo inoculado del suelo a las placas de agar de extracto de malta, primero, identifique los inóculos del suelo que tienen un crecimiento micelial visible, agregue el caldo de dextrosa Sabouraud al límite del aire. Luego use palitos aplicadores de punta lisa de madera esterilizados para transferir el micelio al centro de una placa de agar de extracto de malta e incube estas placas de agar de extracto de malta a 37 grados Celsius durante tres días. Para la selección de micelios, con propiedades morfológicas de Aspergillus fumigatus, identifique las colonias de moho que tienen un crecimiento característico de tipo verde balanceado.
Dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, recolecte conidios o micelios raspando la superficie una vez que use palos aplicadores de punta plana de madera esterilizados o un lazo de inoculación y transfiéralo al centro de una placa de agar de extracto de malta rayando en el agar para colonias individuales. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante dos días. Usando una barra de aplicación estéril o un bucle de inoculación, subcultiva una sola colonia generada en el agar de extracto de malta al rayar la colonia una vez.
Extienda las esporas cosechadas en el centro de la placa. Prepare una solución estéril de glicerol al 30% para cosechar las esporas o micelios de Aspergillus fumigatus para el almacenamiento en cultivo. Después de los dos días de incubación de las placas de agar a 37 grados centígrados, aspire un mililitro de la solución de glicerol al 30% con una pipeta y disperse sobre la colonia de Aspergillus fumigatus.
Para la identificación fenotípica de las cepas de Aspergillus fumigatus, aspire 10 microlitros de las existencias de micelios y esporas para agregar 990 microlitros de agua. Vórtice esta suspensión de esporas diluida y dispense 10 microlitros de la suspensión en un portaobjetos de microscopio estándar. Luego, utilizando un microscopio compuesto con un aumento de 400X, vea la suspensión y localice los conidióforos.
Compare la morfología del conidióforo observada con la morfología del conidióforo de Aspergillus fumigatus. Para determinar el tamaño de fragmento correcto para cada uno de los nueve loci microsatélites, utilice un software capaz de análisis de fragmentos. Recupere los datos brutos obtenidos de la electroforesis capilar y califique los tamaños de los fragmentos en función del pico más grande utilizando el software de análisis fragmentado.
A continuación, convierta los tamaños de fragmento en números repetidos para cada uno de los nueve bajos use los tamaños de fragmento de los números de repetición de la cepa de referencia Af293. De 3. 826 muestras de suelo recogidas en 53 ubicaciones en nueve países, se aislaron 1.473 cepas de levadura. La mejor temperatura de incubación para cada país se determinó en función de su temperatura media anual.
En el análisis de rarefacción para cada país, se utilizó el índice de diversidad de Shannon como una medida de la diversidad de levaduras del suelo. Las curvas de rarefacción resultantes se acercaron a la asintota de saturación, lo que indica que no era probable que el muestreo adicional hubiera producido más diversidad de levaduras. El crecimiento micelial en las placas formó la morfología verde balanceada típica de Aspergillus fumigatus.
Otras especies de hongos termotolerantes podrían estar presentes dentro de la misma muestra de suelo y cultivar el Aspergillus fumigatus en la misma placa o por sí mismos. La estructura del conidióforo de Aspergillus fumigatus vista e identificada mediante microscopía de luz reveló que los conidióforos tienen una bola en la morfología del palo y los conidióforos son uniseriados, donde los fialides unidos a las cadenas de conidios están unidos directamente a la vesícula esférica. Un biseriato generado por cromatograma reveló los tres canales que visualizan las longitudes de los fragmentos de Aspergillus fumigatus dinucleótido, trinucleótido y tetranucleótido corto en tándem repetidos loci.
Se puede generar una red de expansión mínima de alta calidad utilizando el script R plot_poppr_msn o imsn. Un análisis discriminatorio de los componentes principales es otro método para visualizar las relaciones genéticas entre las cepas. La adición de benomilo y cloranfenicol a los medios de crecimiento previene el crecimiento de moho y bacterias, respectivamente, y favorece la selección de levaduras.
El cloranfenicol también reduce la fermentación en los medios, disminuyendo la acumulación de gas en los tubos de incubación. La realización de metagenómica en muestras de suelo proporcionará información adicional sobre la diversidad cultural. Las pruebas susceptibles de cepas de A.fumigatus identificarán la presencia de genotipos de resistencia.
Este protocolo se puede aplicar a otros sistemas de levadura y moho con poca modificación. Facilitó la investigación de la diversidad cultural de levaduras del suelo y sus predictores a escala global.
