Un agradecimiento especial a Kris Ngai y Jason Del Río por su apoyo y ayuda en este proyecto. Este trabajo fue apoyado por subvenciones RO1 GM070676 a SPG.

Las cepas de moscas se pueden comprar y se amplifica en el laboratorio. Dependiendo de la cantidad de frascos de cultivo de Drosophila recibidos, una necesidad de frecuencia &#39;voltear&#39; los frascos de cultivo, una vez que los viales ha alcanzado su capacidad máxima. La ampliación continúa hasta alrededor de 50 frascos de cultivo de Drosophila se llenan. Entonces se hace &quot;volar tazas&quot; con vasos de 100 ml de tres picos (Fly toma la taza se discute en la siguiente sección). Después de 24 horas, uso de embriones a partir de estos vasos a los frascos de cultivo de semillas nuevas de Drosophila con la comida mosca pegada en la parte inferior. A temperatura ambiente, el tiempo de crecimiento para los embriones de Drosophila a partir de embriones durante la noche a completos moscas cultivadas son aproximadamente 8,5 días. Embriones sembrados eclosionan después de 12-15 horas en la primera etapa de las larvas. Las larvas crecen durante unos cuatro días muda dos veces en la etapa de las larvas de segundo y tercer lugar, a las 24 y 48 horas después de la eclosión. Las larvas se encapsulan en pupariums y se somete a una metamorfosis cuatro días hasta que salen de theredero de pupas de los casos 1. Permitir un mayor crecimiento durante aproximadamente dos a tres días en los frascos de cultivo de Drosophila para aumentar la cantidad de moscas en cada uno. Cuando se llenan los frascos de 400, habrá una cantidad suficiente de moscas durante cincuenta tazas de postura de huevos (alrededor de 1,000 moscas hembra por taza). Las moscas necesitan tiempo para adaptarse a su nuevo entorno. Por lo general toma alrededor de dos días para que esté listo para la recolección, después de haber sido transferido a las copas. Sustitución de placas de agar diario mantendrá las tazas de moscas limpias, que permiten a las moscas que viven más tiempo. (Para una mayor comprensión de la atención de Drosophila y de amplificación, por favor refiérase a la Drosophila DB Roberts: Un enfoque práctico 2). Una buena fuente para obtener grandes cantidades de embriones de Drosophila son 3 jaulas de población, que están disponibles comercialmente. El montaje y mantenimiento de las jaulas de la población se puede ver en el capítulo 5 y 7 en el libro de Drosophila melanogaster: PUsos PRÁCTICA en la célula y 4 de la Biología Molecular. Sin embargo, las jaulas de la población son caros y son difíciles de mantener. Dado que las jaulas de población puede mantener una cantidad abundante de moscas, el uso de dióxido de carbono es necesario para la transferencia y la alimentación de las moscas. Como se dijo antes, el dióxido de carbono disminuye la salud de las moscas, causando que no estaba así. A pequeña escala, vasos de precipitados de 100 ml de tres picos puede ser utilizado. Con cincuenta vasos de 100 ml, 9 gramos de dechorionated embriones puede ser alcanzado. Con el fin de eliminar las moscas muertas, la pasta de levadura utilizada y otras impurezas que hemos creado un receptor de doble tamiz de capas con diferentes tamaños de malla. Una trampa de tamiz los materiales no deseados, como las moscas muertas al tiempo que permite pasar a través de embriones (350 micras de tamaño de poro). La segunda parte contiene una malla (120 micras de tamaño de poro), que está destinado a coger embriones de Drosophila y otras impurezas pasarán a través de la malla. 1. Fly Preparación Copa y recolección de embriones <ol><li> Voltearlas moscas amplificados procedentes de varios viales en un frasco de plástico vacío, hasta que la cantidad de moscas han alcanzado una pulgada de altura del frasco. A continuación, transferir las moscas en una taza de 100 ml de huevo colección (vaso de Tricon con malla de nylon las ventanas). Mantenga tocando la copa sobre una superficie dura para evitar el escape de las moscas, cuando la transferencia de las moscas. Cubra la taza con una pasta de levadura que contiene la placa de agar y dejar 24-48 horas de tiempo de estabilización. </li><li> Recoge las placas de agar durante la noche de cincuenta tazas de moscas y lavar el contenido de las placas para el receptor granulométrico con un pincel limpio y agua corriente. La carne de los embriones en el tamiz con agua abundante hasta que toda la pasta de levadura se lava lejos. </li><li> Dechorionate los embriones limpiados por inmersión en 50% de lejía durante 3 min. </li><li> Enjuague con agua destilada hasta que los embriones ampliamente perder el olor a cloro. Después hay que secar la malla con embriones, colocándolo en los tiempos de ac toalla varias veces. Transferencia de los embriones a un tubo de ensayo limpio y registrar el peso. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Embriones homogeneización y clarificación <ol><li> Coloque dechorionated embriones en homogeneizador Dounce con volumen x 1,5 de tampón de extracción enfriado con hielo. </li><li> Haga 5 golpes con la mano del mortero suelto. Alícuota del homogeneizado en tubos de centrífuga limpios. Centrifugar a 15.000 g durante 40 min. a 4 ° C. </li><li> Recoger cuidadosamente el líquido sobrenadante claro sin la capa de lípidos superior de color blanco o la parte inferior de pellets. </li><li> Transferir el sobrenadante para limpiar los tubos de centrífuga y se centrifuga a 50.000 g durante 30 min. a 4 ° C </li><li> Como resultado de alta velocidad sobrenadante recogido como se explicó anteriormente puede ser utilizado inmediatamente o puede ser broche de congelados y almacenados a -80 ° C durante meses. </li></ol> 3. Microtúbulos polimerización y unión Kinesin <ol><li> Descongele el congelado de alta velocidad sobrenadante a temperatura ambiente. Para polimerizar microtúbulos, añadir GTP (0,3 mM) y taxol (20 mM) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 20 min enun agitador rotatorio. </li><li> Para enlazar quinesina, añadir 2,5 mM de ATP no hidrolizable analógico 5&#39;-ciclasa imidodiphosphate (AMPPNP), seguido por una agitación de 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. </li></ol> 4. Diferencial de sedimentación de los microtúbulos y Kinesin <ol><li> Los sedimentos a través de una almohadilla de sacarosa volumen igual (20% de sacarosa y 10 taxol mM en tampón de extracción) por centrifugación a 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) durante 30 min. a 4 ° C. </li><li> Lavar precipitado por resuspensión en 10% de volumen original homogeneizado en tampón de extracción que contiene 10 mM de taxol y 75 mM de NaCl. </li><li> Repetir la sedimentación con otro cojín volumen de sacarosa igual que en el paso 4,1. </li><li> Vuelva a suspender sedimento lavado de la sal en tampón de extracción 5% con 20 mM de taxol, 75 mM de NaCl, 10 mM de MgSO 4, y 10 mM de ATP. </li><li> Los sedimentos en 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) durante 20 minutos a 4 ° C. Recoger el sobrenadante (kinesinfracción). </li><li> Realizar una filtración centrífuga a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recuperar muestra concentrada y repetir la filtración con un filtro de nuevo como anteriormente durante 30 minutos y se recoge la muestra concentrada. </li><li> Realizar un ensayo de proteínas para determinar la concentración. Brevemente, variando las concentraciones de una proteína conocida (albúmina de suero bovino; BSA) se mezcló con un volumen conocido de reactivo de Bradford y se midió la densidad óptica a la longitud de onda 595nm. Entonces una densidad óptica frente a la curva estándar de concentración se estableció para calcular la concentración desconocida de fracción purificada quinesina utilizando la densidad óptica de esta muestra medido bajo condiciones similares a la de las muestras de BSA estándar. La electroforesis en gel, así como el Western Blot También se realizó utilizando una cantidad conocida de la quinesina purificado. </li><li> Fracción alícuota de kinesina en pequeños volúmenes de concentración deseada y la congelación de complemento en nitrógeno líquido para almacenar a -80 ° C. </li></ol> De longitud completa Kinesin funcional se purificó a partir de embriones de Drosophila. La Figura 1 muestra el gel teñido con plata que muestra las diferentes fracciones durante la purificación. El carril 1 es una muestra del sobrenadante de alta velocidad después de la clarificación (paso 2,5), carril 2 es una muestra del sedimento después de la clarificación, carril 3 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación primero con colchón de sacarosa (paso 4,1), carril 4 Se una muestra del sedimento después de la sedimentación primero, carril 5 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación segundos (paso 4,3), carril 6 es una muestra del sedimento después de la sedimentación segundo, carril 7 es una muestra de la pastilla de la sedimentación final (paso 4,5), carril 8 es la muestra quinesina purificada, carril 9 es la muestra quinesina filtró, y el carril 10 es el marcador. La banda se concentró en el carril 8 y 9 a alrededor de 115 kD es quinesina la cadena pesada de 1, lo cual es consistente con Figure 1, carril 8 del documento Saxton publicado en 1988 5. Figura 2 representa la mancha c occidental de la fracción purificada quinesina detectaron utilizando el anticuerpo quinesina cadena pesada. El anticuerpo AKINO1-A no significativamente reacción cruzada con otros miembros de la familia kinesin 6. Nótese que aunque este protocolo resulta en una buena fuente de quinesina funcional, mientras que la fracción se enriquece para quinesina-1, hay contaminantes posibles, incluyendo potencialmente kinesins otros y otras proteínas de motor. Hemos eliminado una variedad de contaminantes más pequeños por filtración. En cuanto a la eliminación de otros motores que no pueden ser realizados por tamaño por sí solo, la purificación es similar a lo que se hizo por otros para estudiar quinesina 7, y creemos que la mayoría del motor activa es Kinesin-1, pero purificación más sofisticado permitir que eliminación de los contaminantes motores potenciales, como se hizo por Cole et al 8 y Saxton et al. 9 </p&gt; La procesividad de quinesina se evaluó in vitro por un solo ensayo microtúbulos molécula de unión, tal como se describe con más detalle en el libro de Scholey titulado &quot;ensayo de motilidad de las proteínas del motor&quot; 10. Brevemente, perlas de poliestireno con un motor activo solo se pone en contacto con los microtúbulos, en presencia de saturar (1 mm) ATP. El motor unido a los microtúbulos, y comenzó a caminar lejos del centro de la trampa láser. En un desplazamiento predefinido del talón desde el centro trampa (100 nm) la potencia del haz láser se convirtió automáticamente fuera, permitiendo que el motor de caminar a lo largo de la MT sin carga. La película muestra un diámetro de 500 nm de perlas con kinesin sola caminando por MT. La longitud de la pantalla de vídeo corresponde a 20 micras. Figura 3 representa la distribución medida de run-longitudes individuales para las moléculas de longitud completa de Drosophila kinesin, purificado de acuerdo con el protocolo presentado aquí. El exponentiAl ajustarse a la distribución proporciona la longitud de recorrido promedio de una sola kinesina 1,55 ± 0,1 m y 1,28 ± 0,12 micras para la muestra filtrada y no filtrada, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 gel de plata manchado de las fracciones purificadas. Muestras de cada fracción se corrieron en un gel de 10%. 10 g de proteína se cargó en cada carril. El carril 1 es una muestra del sobrenadante de alta velocidad después de la clarificación (paso 2,5), carril 2 es una muestra del sedimento después de la clarificación, carril 3 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación primero con colchón de sacarosa (paso 4,1), carril 4 Se una muestra del sedimento después de la sedimentación primero, carril 5 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación segundos (paso 4,3), carril 6 es una muestra del sedimento después de la sedimentación segundo, carril 7 es una muestra de la pastilla de la sedimentación final (paso 4,5), carril 8 es la quinesina purificómuestra, carril 9 es la quinesina filtró utilizando un 100 kD de corte Amicon Ultra 0,5 ml de filtro centrífugo (Millipore, EE.UU.). Las flechas azules indican las proteínas cuyos montos se redujeron y la flecha roja indica la concentración de la quinesina debido a la etapa de filtración centrífuga utilizada en este protocolo. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="Figura 2" /> . Figura 2 purificada fracción KHC borrados contra anti-anticuerpo quinesina: purificada muestra quinesina se sometió a electroforesis en gel y borrado (en la membrana de nitrocelulosa) contra el anticuerpo primario AKINO1-A (1:1.000 en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por incubación en Donkey-anticuerpo anti-conejo (1:10,000 en TBST) durante una hora a temperatura ambiente. Un ECL (quimioluminiscente) kit se utiliza para detectar la señal quinesina se muestra arriba. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. </strong&gt; RunLength y la velocidad de la quinesina sola longitud de Drosophila completo: (A) y (B) longitud de recorrido y la velocidad de la muestra filtrada quinesina. (C) y (D) RunLength y la velocidad de muestra quinesina sin filtrar. Figura 4. Vídeo de la motilidad Kinesin. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video</a> .

<ol>
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No tenemos nada que revelar.

Cerebro bovino es el material más utilizado para purificar a partir 11 de longitud completa quinesina, aunque el cerebro murino se ha utilizado como bien 12. Una gran desventaja del uso de cerebro bovino como fuente quinesina es la disponibilidad de material fresco de partida: mataderos son típicamente inaccesible, y el cerebro debe ser extremadamente fresco con el fin de obtener quinesina activo. Además, sólo los cerebros de vacas jóvenes son eficaces. Por último, la manipulación genética ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Agar (granulada) </td><td> Pescador </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrosa (D-glucosa) anhidro </td><td> Pescador </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Estilo de 60x15mm (Poliéster) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Cultura Viales </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricornio vaso de precipitados </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volumen: 100 ml, Tamaño: 58x72mm </td></tr><tr><td> Levadura </td><td> Estrella Roja </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Malla de nylon </td><td> Genesse Científico </td><td> 57-102 </td><td> 120 mIcron tamaño de poro </td></tr><tr><td> Malla de nylon </td><td> Piezas pequeñas </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Tubería </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tubería </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anhidro) </td><td> Pescador </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> AprotOnin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> Infecciones de transmisión sexual </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analógica 5&#39;-ciclasa imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra centrífugas Filtros: 0.5 ml, 100kD cortadas, paquete de 8 </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Proteínas motoras se mueven cargas a lo largo de los microtúbulos, y transportarlos a determinados lugares subcelulares. Dado que el transporte alteración se sugiere que la base de una variedad de enfermedades neurodegenerativas, la comprensión de los microtúbulos de transporte basada en el motor y su regulación es probable que en última instancia conducir a mejores estrategias terapéuticas. Kinesin-1 es una proteína motora eucariotas que se mueve en una dirección anterógrada (más extremo) a lo largo de los microtúbulos (MT), impulsado por la hidrólisis de ATP. Aquí se presenta un detallado protocolo de purificación para aislar kinesina activos de larga duración a partir de embriones de Drosophila, lo que permite la combinación de la genética de Drosophila con los estudios de una sola molécula biofísicos. A partir de aproximadamente 50 tazas de ponedoras, con aproximadamente 1.000 mujeres por cada taza, se llevó a cabo las colecciones de la noche. Esto proporcionó aproximadamente 10 ml de embriones envasados. Los embriones fueron dechorionated cloro (que produce aproximadamente 9 gramos de embriones), y se homogeneiza a continuación. After interrupción, el homogenado se aclaró mediante un giro de baja velocidad seguido por una centrifugación a alta velocidad. El sobrenadante clarificado se trató con GTP y el taxol para polimerizar MTs. Kinesin se inmovilizó sobre polimerizado MTs añadiendo el análogo de ATP, 5&#39;-ciclasa imidodiphosphate a temperatura ambiente. Después de quinesina unión, los microtúbulos se sedimentaron mediante centrifugación a alta velocidad a través de un colchón de sacarosa. El sedimento de los microtúbulos se volvió a suspender, y este proceso se repitió. Por último, el ATP se añadió para liberar la kinesina de la MT. Centrifugación de alta velocidad luego centrifugadas la MT, dejando la quinesina en el sobrenadante. Este quinesina se sometió a una filtración centrífuga utilizando un corte 100 KD fuera filtro para una purificación adicional, alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C. Electroforesis en gel SDS y Western Blot se realizó utilizando la muestra purificada. La actividad motora de muestras purificadas antes y después de la etapa final de filtración centrífugase evaluó mediante un ensayo in vitro de una sola molécula de microtúbulos. Las fracciones kinesin antes y después de la filtración centrífuga mostró procesividad como ya se ha informado en la literatura. Otros experimentos están en marcha para evaluar la interacción entre kinesina y otras proteínas relacionadas con el transporte.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Este es un protocolo para aislar Kinesin activos de larga duración de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Para los estudios de embriones de una sola molécula biofísicos. Mostramos cómo recoger los embriones, hacen que el lisado de embrión, y luego se polimerizan los microtúbulos (MTS). Kinesin se purifica mediante la inmovilización de que en el MT, girando hacia abajo los complejos MT Kinesin-, y luego soltar el kinesina de la MTs mediante la adición de ATP.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K vistas.  University of California, Irvine. Este es un protocolo para aislar Kinesin activos de larga duración de la Drosophila Para los estudios de embriones de una sola molécula biofísicos. Mostramos cómo recoger los embriones, hacen que el lisado de embrión, y luego se polimerizan los microtúbulos (MTS). Kinesin se purifica mediante la inmovilización de que en el MT, girando hacia abajo los complejos MT Kinesin-, y luego soltar el kinesina de la MTs mediante la adición de ATP.

Video: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Investigación

Biología

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...