La dificultad con una sola sustitución de residuos es genotipar animales de manera eficiente a pesar de la diferencia en un solo residuo. El uso especial de una enzima de restricción agrega solo un paso único, rápido y de bajo costo al genotipado típico basado en PCR. Este protocolo se puede aplicar a cualquier otro modelo de ratón con un punto de mutación si la secuencia objetivo es reconocida por una enzima de restricción, que suele ser el caso.
Corte de uno a tres milímetros de la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de ocho tiras de 0.2 mililitros. Después de contener la muestra de cola como se describe en el manuscrito, guárdela a T-menos 20 grados Celsius hasta la extracción, hasta aproximadamente una semana. Agregue 100 microlitros de solución de lisis tisular por tubo y mezcle bien, seguido de spin-down usando una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.
Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución. Coloque los tubos en un conjunto de termocicladores programando los parámetros para la lisis del tejido, la inactivación y la sujeción. Guarde el lisado tisular a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana si la PCR no se puede realizar de inmediato.
Prepare una solución de PCR que contenga cinco microlitros de agua libre de nucleasas, 0,75 microlitros de cebadores de 10 micromolares hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 microlitros de mezcla maestra de PCR por muestra en un nuevo tubo de PCR. Añadir un microlitro del lisado tisular previamente preparado a la solución de PCR. Mezcle bien la solución de PCR y gire hacia abajo con una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.
Coloque los tubos en un termociclador programado. Una vez que se complete la reacción, almacene los productos de PCR a cuatro grados Celsius durante uno o dos meses o aproximadamente un año a menos 20 grados Celsius. Prepare la solución enzimática que contiene siete microlitros de agua libre de nucleasas, dos microlitros de tampón CutSmart a una fuerza de 10X y un microlitro de enzima de restricción NlaIII.
Si hay varias muestras, multiplica cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 microlitros por tubo. Añadir 10 microlitros de producto pcr previamente obtenido a la solución enzimática por tubo. Mezcle bien y gire hacia abajo con la minicentrífuga de mesa como se demostró anteriormente.
Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor programado. Almacene el producto después de la incubación en condiciones frías. Agregue 0.75 gramos de agarosa en 50 mililitros de tampón TAE de una sola fuerza.
Mezclar y calentar la agarosa en el microondas hasta que se disuelva por completo. Después de enfriarlo, agregue cinco microlitros de tinción de ADN y mezcle suavemente. Vierta 25 mililitros del gel de agarosa en el molde de gel y permita que el gel se solidifique.
Cargue 10 microlitros de producto pcrendido digerido al pozo. Haga funcionar el gel con 100 voltios durante 35 minutos. Imagen del gel de agarosa bajo luz ultravioleta.
La electroforesis de agarosa realizada utilizando el producto de PCR digerido dio como resultado varias bandas de diferentes tamaños en cada genotipo, con dos bandas en tipo salvaje, tres en heterocigotos y una en homocigotos, respectivamente. La inyección de prueba con análisis de blastocistos dio como resultado una tasa de éxito del 76,9% en la inyección de 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes, y una tasa de éxito del 25% en la inyección de 25 nanogramos por microlitro de los mismos oligos donantes, respectivamente. Finalmente, inyectando 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes con precipitación de etanol se obtuvieron animales fundadores con una tasa de éxito del 50%.
La purificación de oligo donantes por precipitación de etanol redujo la toxicidad al tiempo que mantuvo una alta eficiencia de edición del genoma. El manejo cuidadoso y la adición de una baja cantidad de reactivos es muy importante. Asegúrese de que se agreguen correctamente y se mezclen bien.
