Este método experimental permite el almacenamiento a largo plazo de las células individuales reutilizables para pruebas epigenómicas. También permite el análisis de muchas marcas epigenéticas y factores de transcripción en la misma célula. En los métodos actuales para el análisis del epigenoma de una sola célula, las mismas células individuales no se pueden volver a analizar.
Sin embargo, con células individuales reutilizables, las mismas células individuales se pueden volver a analizar muchas veces. Esta técnica es útil para el diagnóstico y diseño de la terapia epigenética, particularmente cuando las células del paciente son limitadas en número. Este método es más adecuado para el estudio del epigenoma, la regulación de la expresión génica y otros sistemas, siempre que se disponga de anticuerpos específicos para marcas epigenéticas.
Cuando pruebe esta técnica por primera vez, le recomendamos que practique en muestras que no sean demasiado preciosas y valide el experimento utilizando secuenciación superficial como MiSeq o iSeq 100. Para comenzar, en una campana de flujo laminar limpia, mezcle un mililitro de suspensión celular y 199 mililitros de un PBS EDTA milimolar que contenga un colorante intercalador para el ADN. Después de mezclar, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de fondo plano de 96 pocillos.
Coloque la cubierta en la placa de 96 pocillos y escanee la placa con un microscopio de barrido. A continuación, incline la placa y espere unos minutos hasta que la celda individual se haya hundido en el borde inferior del pozo. A continuación, coloque la punta de la pipeta en la esquina inferior y transfiera la célula individual y el tampón a un tubo de PCR.
Verifique el pozo con un microscopio de fluorescencia para confirmar la transferencia. Si una sola célula todavía está en el pozo, agregue 200 microlitros por pocillo de un PBS EDTA milimolar que contenga un colorante intercalador para el ADN y repita la transferencia. Después de la transferencia, coloque una cubierta en la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugue la placa con un rotor de giro sin interrupción.
Después de la centrifugación, coloque la placa en la cubierta de un robot automático de manejo de líquidos. A continuación, arrastre y suelte el código suplementario uno a la ventana de software del robot de manejo de líquidos y ejecute el programa para eliminar 195 microlitros del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta. Agregue 50 microlitros de 4% TEMED o aceite mineral e incube la placa durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, retire el aceite mineral pipeteando y lave las células cinco veces con 200 microlitros de tampón negativo de magnesio TP. Después del último lavado, retire el sobrenadante, agregue 15 microlitros de tampón recocido e incube en hielo durante una hora. Después de la incubación, coloque los tubos de PCR en un termociclador y caliente a 94 grados centígrados durante tres minutos.
Luego transfiera los tubos a un bloque de metal enfriado por hielo e incube durante dos minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de sulfato de magnesio-cloruro de sodio, mezcla de DNTP y mezcle por vórtice a una velocidad máxima. Luego agregue un microlitro de fragmento grande de polimerasa BST, mezcle por vórtice e incube durante cuatro horas en un agitador.
Después de la incubación, coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute un programa de cuatro horas o durante la noche como se describe en el texto. Para la unión de anticuerpos, agregue 1.625 microlitros de solución BSA de cloruro de sodio EDTA al tubo. Mezclar por vórtice a baja velocidad e incubar el tubo en hielo durante una hora.
Luego agregue 0.1 microgramos por mililitro de anticuerpo y controle IgG conjugado con la sonda de anticuerpos. Después de agregar los anticuerpos, incubar los tubos en hielo con una agitación suave. Al día siguiente, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón TPM-T en hielo.
Luego retire el sobrenadante y lávese una vez con tampón de ADN ligasa T4. A continuación, agregue 19 microlitros de solución adaptadora de ligadura e incube durante una hora a 25 grados centígrados. Luego, agregue un microlitro de ADN ligasa T4 y mezcle el tubo mediante vórtice a velocidad media.
Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el programa de ligadura de proximidad. Después de la carrera, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón positivo con EDTA negativo para magnesio BST y almacene las células durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón negativo con EDTA negativo de magnesio BST y agregue 20 microlitros de una mezcla que contenga BST, DNTP y sulfato de magnesio.
Luego mezclar con un mezclador de vórtice e incubar el tubo durante cuatro horas en un agitador orbital. Después de la incubación, coloque el tubo en un termociclador y ejecute el programa de extensión completo como se describe en el texto manuscrito. A continuación, para la amplificación de desplazamiento múltiple, agregue 0.4 microlitros de 100 micromolares segundos cebadores aleatorios y mezcle por vórtice.
Luego, incubar el tubo durante dos horas en un agitador orbital antes de colocar el tubo en un termociclador para calentar a 94 grados centígrados. Después de tres minutos, coloque los tubos en un bloque de metal enfriado con hielo y agregue un microlitro de ADN polimerasa BST. Vórtice los tubos a baja velocidad.
Luego coloque los tubos en un termociclador para ejecutar el programa de amplificación de desplazamiento múltiple. Después del programa, transfiera aproximadamente 20 microlitros de sobrenadante a un tubo de PCR y guárdelo a menos 80 grados centígrados. A continuación, agregue 20 microlitros de tampón TE 0.05% TWEEN 20 y 0.1X a un tubo de PCR que contenga la célula individual reutilizable e incube el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, recoge el sobrenadante y combínalo con el sobrenadante recogido previamente. Luego, remoje la célula única reutilizable y el tampón TBS que contiene 50% de glicerol, cinco EDTA milimolares, 0.5% BSA y 0.05% TWEEN 20, luego incubarlo durante 30 minutos en un agitador orbital. Después de la incubación, almacene la celda individual reutilizable a menos 20 grados centígrados hasta que se vuelva a usar.
Finalmente, agregue 40 microlitros de mezcla maestra negativa Exo y coloque el tubo en un termociclador para ejecutar el programa como se describe en el texto manuscrito. Las celdas individuales reutilizables K562 se generaron utilizando este protocolo. Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida y se visualizaron utilizando un tinte intercalador para la tinción de ADN.
Los productos de ADN antes y después de la digestión BciVI se muestran aquí. La digestión de la enzima de restricción generó los fragmentos esperados de 19 a 20, 31 a 32, 49 y más de 49 pares de bases. Además, la biblioteca de ADN construida se analizó mediante electroforesis capilar para los productos deseados.
Los resultados de la secuenciación indicaron que las lecturas mapeadas únicas de lisina acetilada 27 anti-histona H3 y lisina 27 trimetilada anti-histona H3 fueron significativamente más numerosas que las de la IgG de control. Las señales de secuenciación REpi se evaluaron comparando los datos de secuenciación REpi con los datos de secuenciación ChIP masivos. En promedio, aproximadamente el 91% de las señales de lisina 27 acetilada de histona H3 de la secuenciación REpi se superpusieron con los picos de lisina acetilada 27 de la histona H-3 en la secuenciación masiva de ChIP.
La precisión de la secuenciación REpi para la marca de histona inactiva, histona H3 trimetilada lisina 27 fue del 52%La sensibilidad de la secuenciación REpi se analizó para medir cuántos picos de secuenciación ChIP masiva se detectaron mediante lecturas reproducidas de secuenciación REpi. La sensibilidad de la secuenciación de REpi fue del 55,30% en la histona H3 acetilada lisina 27 y del 50,94% en la histona H3 trimetilada lisina 27. Asegúrese de utilizar reactivos sin DNS.
Además, todas las operaciones que involucran los cables del tubo de apertura o los cables del reactivo deben realizarse en una campana limpia. Los productos de ADN de este procedimiento se secuencian y luego se mapean al genoma para revelar qué modificaciones de histonas están presentes, en qué regiones del genoma en células individuales. Esta tecnología hizo posible analizar múltiples marcas epigenéticas en la misma célula individual y allanó el camino para el análisis multiómico en cualquier célula individual.
