Describimos nuestro protocolo para aislar las células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y un método robusto para diferenciarlas en linaje del músculo esquelético. Esta técnica nos permite aislar células madre mesenquimales que poseen alta viabilidad y calor, con poca o ninguna contaminación de células de origen endotelial e inducir la diferenciación miogénica de manera eficiente en estas enfermedades. La torsión del cordón y la consistencia mucoide dificultan el manejo del cordón.
Mostramos cómo procesar el cordón, para no raspar la gelatina de Wharton y excluir las células endoteliales de la población. Después de recolectar el tejido del cordón umbilical en el momento del parto, transfiera la pieza de tejido del cordón umbilical del tubo de recolección a un plato tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros cuadrados y lave bien el tejido con PBS fresco. Para cuidar la torsión del cordón umbilical y la superficie mucoide, fije el tejido con un par de fórceps sostenidos en una mano.
Usando un bisturí, corte el tejido del cordón verticalmente a lo largo de su acceso longitudinal para obtener dos piezas medio cilíndricas. En este punto, observe las arterias y venas umbilicales. Usando un bisturí, retire los vasos sanguíneos raspándolos en una dirección de la superficie y enjuague el tejido del cordón umbilical en PBS para eliminar toda la sangre residual asociada con el tejido.
Picar cada mitad del tejido del cordón umbilical en fragmentos de 0,5 centímetros cúbicos de tamaño. Coloque los fragmentos con la superficie luminal hacia abajo en el plato e incube el plato brevemente durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 20 mililitros de medio que contengan la modificación MEM Alpha suavemente a lo largo de los lados del plato que contiene el tejido del cordón umbilical.
Asegúrese de que los explantes no se desalojen de su orientación y agregue el exceso de medio para dar cuenta de una fracción que los explantes de tejido absorberán durante la incubación. Luego coloque el plato en la incubadora durante tres días. Después del final de la incubación, agregue medio fresco al cultivo y asegúrese de que los cultivos estén protegidos de los choques y el movimiento de los explantes mientras manipula los platos.
Después de una semana, usando fórceps estériles, retire los fragmentos de tejido individualmente y deséchelos usando bolsas de riesgo biológico apropiadas para su eliminación. Conserve el medio existente y agregue 10 mililitros de medio de crecimiento fresco. Reemplace el medio de crecimiento cada cuatro días hasta que las colonias individuales alcancen una confluencia del 70% Después de teñir las células como se describe en el manuscrito, analice las células marcadas por citometría de flujo y determine el porcentaje de células CD105 CD90 positivas y CD105 CD73 positivas.
Analice las células CD105 positivas y CD34 CD45 negativas por separado. Cubra la placa de cultivo de tejidos con 0.01% de colágeno y 20 microgramos por mililitros de laminina en PBS y colóquela en el balancín durante un mínimo de cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el colágeno y lave la placa con PBS, luego placa uMSC a 10, 000 células por centímetro cuadrado de densidad en el medio de crecimiento.
Una vez que las células alcanzan el 70% de confluencia, aspire el medio de crecimiento y enjuague la placa de cultivo dos veces con PBS. Para determinar la cinética de la progresión miogénica, agregue medio M1 cada dos días a los cultivos y analice las uMSC para la expresión de pax7, MyoD, miogenina y miosina de cadena pesada a los dos días, de cuatro a cinco días, de seis a siete días y de diez a catorce días respectivamente. Las uMSC muestran la expresión de CD105 y CD90, y no expresan marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45.
Las uMSC también fueron positivas para la expresión del marcador uMSCs CD73, lo que indica que las uMSCs expresaron múltiples marcadores clave. Las uMSC mostraron expresión de pax7 dentro de los primeros dos días de la adición de M1, seguida de la expresión de MyoD dentro de los primeros cuatro días de adición de M1. Las células expresan la proteína miogenina a los seis días de diferenciación, seguida de la expresión de la cadena pesada de miosina entre 10 días y 14 días de la inducción de la diferenciación.
970 genes fueron regulados al alza en respuesta a la inducción de la diferenciación miogénica en comparación con las uMSC indiferenciadas. Más genes miogénicos fueron regulados al alza en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical en comparación con las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical. Tanto el tejido del cordón umbilical como la sangre del cordón umbilical mostraron una regulación al alza de los genes relacionados con las proteínas citoesqueléticas, asociados con la unión a la actina y el ensamblaje de los sarcómeros, los transportadores asociados con la función contráctil, el mantenimiento de la masa muscular, la señalización del calcio y la función enzimática.
Recoger el tejido en condición aséptica y mantener el cultivo estéril. El cordón debe barrerse externamente con etanol al 70% y procesarse lo más rápido posible. Muchas terapias regenerativas requieren un gran número de células de los primeros pasajes.
También se puede utilizar como modelo para imitar todo el ambiente seco y reflejar el metabolismo postnatal.
