Este protocolo permite al usuario medir cuantitativamente marcadores clínicamente análogos de daño en imágenes de retina de ratón, lo que refuerza la traducibilidad de los hallazgos posteriores. Estos métodos nos permiten agilizar el análisis y nos dan la capacidad de comparar de manera confiable las imágenes entre animales de experimentación. Si bien estos métodos se desarrollaron para estudiar una visión general del modelo de ratón, pueden extenderse fácilmente a la investigación sobre cualquier enfermedad de la retina que utilice las mismas técnicas de imagen.
Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina de tomografía de coherencia óptica y la plataforma de ratón calentado. Encienda el equipo y abra el programa de imágenes. Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida a cada ojo.
Inyectar 100 microlitros de fluoresceína al 1% intraperitoneal. Coloque el ratón en la plataforma. Ajuste la altura y el ángulo de la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada.
Tome una foto del fondo de ojo. Abra el software de imagen y tomografía de coherencia óptica. En el programa de tomografía de coherencia óptica ajustar el empujón a 10.
Tome una imagen de tomografía de coherencia óptica, agregue 75 micrómetros distales de la quemadura. Repita para los otros tres cuadrantes de la retina. Cambie la cámara a un filtro de 488 nanómetros.
Aumente la ganancia de la cámara a 5. Tome una foto del fondo de ojo exactamente 5 minutos después de la inyección de fluoresceína. Abra la imagen de fluoresceína en el software de procesamiento de imágenes.
Duplique la imagen. Usando una herramienta de selección, rastree cuidadosamente los vasos principales. Ignore cualquier vaso que se ramifique de estos recipientes.
En la primera imagen, elimine la selección, dejando solo el recipiente. Guarde esta imagen enmascarada. Mueva la selección a la segunda imagen, invierta la selección y elimine, aislando el fondo.
Guarde esta imagen enmascarada. Abra la imagen de fondo y mida la densidad integrada. Abra la imagen de los vasos, seleccione el contorno de los vasos y, a continuación, mida la intensidad media.
Divida la densidad integrada del fondo por la intensidad media de los vasos, generando la relación de fuga para el ojo. Registre esta relación de fuga para cada ojo en una cohorte experimental. Para controlar aún más el fondo, normalice los ojos experimentales a la proporción media de fugas de los ojos de control no lesionados.
Abra la imagen de tomografía de coherencia óptica en el software de procesamiento de imágenes. Trazar los bordes de la capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa fotorreceptora y la capa de EPR. Exporte los archivos como CSV.
Mida el grosor medio de cada capa y repita para cada ojo en la cohorte experimental. Abra la imagen de tomografía de coherencia óptica en la imagen J.Con la herramienta de línea, mida la distancia donde el borde superior de la capa plexiforme externa es indistinto. Mide horizontalmente, manteniendo la latitud donde comienza la desorganización.
Calcula la suma de las distancias desorganizadas en la imagen. Divide la duración de la desorganización por la longitud total de la retina para obtener la proporción de desorganización. Repita la medición y el cálculo de las imágenes de tomografía de coherencia óptica de los otros tres cuadrantes de la retina.
Tomemos la media de las proporciones de desorganización de las cuatro imágenes de tomografía de coherencia óptica. Este número representa la desorganización promedio para toda la retina. Repita para cada ojo en la cohorte experimental.
Las imágenes enmascaradas utilizadas para el cálculo de la relación de fuga para cada imagen de retina se pueden comparar con otras y analizar, separando la vasculatura principal de otras áreas de la retina. La cuantificación de fluoresceína permite la comparación de la gravedad de la lesión y la eficacia del tratamiento, así como el estudio de los cambios en la fuga a lo largo del curso de la lesión. Se observa una delineación de las capas de la retina en una imagen de OCT.
La cuantificación del grosor de cada capa retiniana muestra que la respuesta edematosa inicial tiene un efecto más profundo en las capas internas de la retina. A partir de un análisis de un curso de tiempo de daño de oclusión de la vena retiniana, se puede observar la hinchazón inflamatoria inicial de las capas retinianas y el eventual adelgazamiento degenerativo. La capa nuclear interna experimenta una respuesta mucho mayor a la lesión inicial, pero la capa plexiforme interna demuestra un adelgazamiento más severo después de que el edema inicial se ha estabilizado y regresa a la línea de base.
La desorganización de la capa interna de la retina se manifiesta como una desaparición del límite superior de la capa plexiforme externa, mezclando las capas plexiforme externa y nuclear interna. La desorganización retiniana de dos grupos experimentales se comparó para investigar la eficacia de un inhibidor en la mitigación del daño retiniano. La calidad de imagen es de vital importancia para la calidad del análisis.
Al adquirir imágenes de la retina, tómese el tiempo para asegurarse de que el fondo de ojo y las capas de la retina estén lo más claras y enfocadas posible. Estos métodos no invasivos se pueden utilizar longitudinalmente y junto con el estudio bioquímico e inmunohistoquímico del tejido para crear perfiles más multifacéticos y detallados de la enfermedad. Esta técnica permite la cuantificación fiable de datos de imágenes retinianas in vivo en modelos de enfermedad neurovascular para que los datos puedan traducirse más fácilmente a la enfermedad humana.
