El protocolo proporciona un modelo para investigar los mecanismos de lesión vascular y el posterior desarrollo de edema de una manera no invasiva. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir la lesión en vivo a lo largo del tiempo sin intervención quirúrgica. Esto proporciona vías para probar tratamientos de manera más eficiente.
Puede ser difícil aprender a realizar el veneado adecuado de la cola y acomodar al animal en la plataforma correctamente. Para ambas técnicas recomiendo ser paciente y tomar las cosas con calma. Para comenzar, maneje suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina, luego encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.
Encienda la computadora y abra el programa de imágenes. Coloque un pedazo de papel blanco frente al ocular del microscopio y ajuste el balance de blancos haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes. Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser.
Para verificar la potencia láser de referencia, ajuste la caja de control láser a 50 milivatios y 2.000 milisegundos. Luego encienda el láser y coloque el medidor de potencia frente al ocular. Presione el pedal del interruptor para activar el láser, con el objetivo de que la lectura de potencia del láser sea de 13 a 15 milivatios.
Luego, usando la pantalla de la caja de control láser, ajuste la potencia del láser experimental a 100 milivatios y 1, 000 milisegundos, y apague el láser. Vierta 300 mililitros de agua en un vaso de precipitados de 500 mililitros y caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante un minuto. Luego coloque una gasa en el agua tibia.
A continuación, coloque un ratón macho de dos meses en un retenedor. Presione suavemente la gasa tibia en la cola del ratón y busque las venas dilatadas. Con una aguja de calibre 26, inyecte la cantidad adecuada de rosa de bengala de acuerdo con el peso del animal y aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado antes de limpiar el sitio.
Luego suelte el mouse del restringido y devuélvalo a la jaula. Espere ocho minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos. Encienda la plataforma del ratón con calefacción.
Luego agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo del ratón. Después de confirmar la anestesia, agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo, luego agregue ungüento para los ojos en ambos ojos. A continuación, inyecte 150 microlitros de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.
Luego acomode el mouse en la plataforma y ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada. Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo. A continuación, encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana aproximadamente a 375 micrómetros del disco óptico.
Irradiar el recipiente presionando el interruptor del pie y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 micrómetros. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto. Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr de dos a tres oclusiones.
Después de irradiar los vasos, apague la lámpara y espere 10 minutos. Luego vuelva a encender la lámpara, cuente el número de venas ocluidas y tome una imagen del fondo de ojo. Después de la adquisición de imágenes y la inyección de solución salina, agregue gotas oftálmicas lubricantes y ungüento de gel en ambos ojos.
Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y devuélvalo a la jaula con otros animales solo cuando esté completamente recuperado. El número de oclusiones logradas inmediatamente después de la irradiación láser no fue diferente entre los animales que fueron sometidos con láser 10 y 20 minutos después de la administración de rosa de bengala. El número de oclusiones sostenidas hasta un día después de la oclusión de la vena retiniana disminuyó significativamente en animales con láser 20 minutos después de la administración de rosa de bengala, independientemente del genotipo.
Sin modificar la potencia experimental de 100 milivatios, una potencia láser de referencia baja de 11,5 milivatios no dio lugar a oclusiones. En contraste, una salida láser de referencia de 13.5 milivatios resultó en oclusiones exitosas. Cuatro tipos principales de oclusiones ocurren después de la fotocoagulación con láser: vasos completamente ocluidos, vasos parcialmente ocluidos, vasos parcialmente reperfundidos y vasos completamente reperfundidos.
La vasculatura irradiada de ratones knockout Casp9 de células endoteliales inducibles por tamoxifeno pasó más tiempo en estados parcialmente reperfundidos y parcialmente ocluidos que la de los ratones C57 Black 6, que pasaron más tiempo en estados completamente ocluidos. El estado de oclusión de los vasos cambia rápidamente dentro de los primeros 10 minutos después de la fotocoagulación con láser y se observan hemorragias en forma de llama 24 horas después de la lesión. Diferentes patologías oftálmicas ocurrieron después de la oclusión de la vena retiniana.
El nivel de edema retiniano después de la oclusión de la vena retiniana se puede cuantificar en los ojos lesionados utilizando imágenes de tomografía de coherencia óptica. El estado de las capas neuronales también se puede determinar evaluando la desorganización de las capas internas de la retina. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen de tomografía de coherencia óptica con las etiquetas correspondientes para cada capa.
Medir la potencia láser de referencia es importante. Esta lectura tendrá un gran impacto en el éxito de las oclusiones y se puede optimizar. Se pueden realizar métodos adicionales como OCT, ERG y Optiger.
Esto ayudará a abordar los efectos de la lesión neurovascular en la integridad neuronal de la retina y la función de la vía visual. Esta técnica allana el camino para interrogar las vías moleculares que impulsan la enfermedad neurovascular y, al seguir a los animales individuales a lo largo del tiempo, proporciona datos que pueden traducirse más fácilmente a la enfermedad humana.
