Este protocolo puede proporcionar a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos y los pasos detallados para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas. No solo puede proporcionar a los investigadores métodos específicos de evaluación celular para adyuvantes, sino que también puede descomponer métodos de extracción como la enfermedad BM. Estos protocolos no solo demuestran que no hay toxicidad y una alta entrega celular, sino que también proporcionan procedimientos detallados para el campo de evaluación adyuvante.
Para comenzar, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Luego, después de recolectar un tubo de células L929 congeladas de nitrógeno líquido, descongele rápidamente en el baño de agua. Después de pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, agregue dos mililitros de DMEM y mezcle bien.
Centrifugar las muestras a 129 x g durante cinco minutos. Y después de desechar el sobrenadante, agregue dos mililitros de DMEM para resuspender las células. Centrifugar las muestras de nuevo.
Y después de desechar el sobrenadante, agregue seis mililitros de medio completo DMEM para la resuspensión, y transfiera a un matraz de cultivo de T25 centímetros cuadrados en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para cultivar durante 48 horas. El día 24 después de la inmunización primaria, retire los ratones de la habitación del animal, colóquelos en un plato de vidrio y sumérjalos en alcohol al 75% durante cinco minutos. Coloque los tubos de la centrífuga en una rejilla para tubos de centrífuga, numere las placas de Petri desechables y agregue cinco mililitros de PBS a cada placa de Petri con una pipeta de 10 mililitros.
Haga una incisión de seis a ocho centímetros con tijeras en el centro del lado ventral izquierdo del ratón. Abra la piel para exponer la pared abdominal y localizar la larga franja roja del bazo. Luego, levante el peritoneo en el lado inferior del bazo con fórceps.
Ábrelo y gíralo hacia arriba para exponer el bazo. Levante el bazo con fórceps. Separe el tejido conectivo debajo del bazo con tijeras oftálmicas y retire el bazo.
Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de PBS y muele con un tamiz y un émbolo de jeringa. Después de moler, transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 mililitros con una pipeta de acuerdo con la numeración. A continuación, centrifugar el líquido a 453 x g durante cinco minutos.
Y después de desechar el sobrenadante, agregue tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo. Resuspender las células y lisar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego agregue de 10 a 12 mililitros de PBS a cada tubo.
Y después de mezclar y centrifugar a 453 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga y resuspenda las celdas. Tome 20 microlitros de cada muestra en un pocillo de la placa de conteo de células y registre el número de células vivas utilizando un contador de células automatizado. A continuación, centrifugar las muestras a 453 x g durante cinco minutos.
Y después de desechar el sobrenadante, diluir a 2.5 x 10 a la sexta celdas por mililitro con medio RF10 y agregar a una placa de 96 pocillos a 100 microlitros por pozo. Corte una incisión de seis a ocho centímetros debajo del abdomen del ratón con tijeras y sujete los dos extremos de la abertura para separarla en diferentes direcciones y exponer las patas del ratón. Separe el fémur del ratón del cuerpo del ratón y la tibia de la articulación.
Y mantenga los huesos intactos en ambos extremos. A continuación, retire el tejido residual y el cartílago de las articulaciones articulares en ambos extremos del fémur con tijeras y fórceps. Remoje los fémures en alcohol al 75% durante cinco minutos y luego sumerja en una solución estéril de PBS para lavar el alcohol de la superficie.
Luego corte los extremos de los fémures con tijeras y enjuague la médula ósea en una placa de Petri estéril con solución estéril de PBS, seguida de aspiración con una jeringa de un mililitro. Repita el lavado de tres a cinco veces. A continuación, filtre mediante un tamiz celular y recoja las células dendríticas derivadas de la médula ósea en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Después de centrifugar las muestras a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos, resuspenda y lise a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 10 mililitros de solución estéril de PBS para neutralizar el lisado, y después de centrifugar a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de DMEM que contenga 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal y recuento.
Luego agregue el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos más interleucina-4 al medio. Ajuste la concentración celular a 5 x 10 al quinto por mililitro e inocule las células en cubreobjetos. Después de agregar la suspensión celular a una placa de seis pocillos a dos mililitros por pozo, coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Cambie el medio completamente después de dos días y cambie la mitad del medio después de cuatro días. Sumerja los ratones en alcohol al 75% después de la eutanasia y colóquelos boca arriba en una placa de Petri de vidrio en orden numerado. Pase los ratones a través de la ventana de transferencia a la sala de operaciones estéril y colóquelos en la mesa de operaciones durante cinco minutos.
Usando la jeringa, aspire 10 mililitros de solución salina. Incline los ratones hacia abajo a aproximadamente 45 grados e inyecte en el centro de la cavidad abdominal. Extraiga aproximadamente cinco mililitros de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros por cada 10 mililitros y repita la inyección tres veces.
Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante cinco minutos para obtener macrófagos primarios peritoneales de ratón. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de NOD. La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune.
La monitorización de linfocitos T citotóxicos con inmunospot ligado a enzimas es el estándar de oro para evaluar la inmunidad de las células T específicas del antígeno en ensayos clínicos y para detectar vacunas candidatas. El aumento de la captación de un antígeno por las células dendríticas puede provocar respuestas inmunes adaptativas mejoradas. Los macrófagos desempeñan un papel importante en la presentación de antígenos a las células T, así como en la inducción de otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas coestimuladoras, iniciando así respuestas inmunes adaptativas.
El aislamiento de las células bajo la proporción de fármaco a la acción celular es de suma importancia.
