Muchos antígenos candidatos de la vacuna de subunidades son proteínas de membrana. Históricamente, estos han sido difíciles de producir y purificar en cantidades suficientes. Con esta técnica, podemos crear antígenos de interés incrustados dentro de una membrana lipídica para ayudar a garantizar una confirmación similar a la nativa.
Este proceso también facilita la formulación con adyuvantes de interés. La expresión libre de células permite la producción rápida de proteínas de interés en su estructura nativa sin etiquetas. Esta técnica también es escalable y ya estamos trabajando con empresas comerciales para desarrollar formulaciones de vacunas utilizando este proceso.
Aquí demostramos el proceso para un antígeno de clamidia, pero el proceso podría adaptarse fácilmente para producir antígenos de interés, independientemente de si son o no proteínas de membrana. Este proceso puede ser aplicable tanto al desarrollo de vacunas contra patógenos como contra el cáncer. Para empezar, prepare MOMP-tNLP empleando un método libre de células.
Descongele el tampón de reconstitución del kit de expresión de proteínas libres de células dos horas antes de configurar la reacción y agregue un inhibidor de la proteasa libre de EDTA al tampón. Utilice un kit diseñado para ejecutar cinco reacciones de un mililitro. Por cada reacción de un mililitro, agregue 525 microlitros de tampón de reconstitución a la botella de lisado de E. coli y enróllela para que se disuelva.
Añadir 250 microlitros del tampón de reconstitución al frasco de reacción que contiene el aditivo y disolver enrollando. A continuación, agregue 8,1 mililitros de tampón de reconstitución a la botella de alimentación de reacción y enróllela para que se disuelva. A un frasco de mezcla de aminoácidos, agregue tres mililitros de tampón de reconstitución para disolverlo.
A otra botella de metionina, agregue 1,8 mililitros de tampón de reconstitución, disuélvalo y guárdelo en hielo. Agregue 225 microlitros de la mezcla reconstituida, 270 microlitros de la mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 30 microlitros de metionina reconstituida a la botella de lisado de E. coli. Además, agregue 400 microlitros de la mezcla DMPC/telodendrimer, 15 microgramos de plásmido MOMP y 0,6 microgramos de delta-49ApoA1 a la mezcla y mézclela.
Alícuota 20 microlitros de la solución total en un tubo de 1,5 mililitros Para una reacción de control que exprese GFP. Prepare una solución de alimentación añadiendo 2,65 mililitros de la mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 300 microlitros de metionina reconstituida. Transfiera un mililitro de la solución de reacción a la cámara de reacción interna en el kit de reacción libre de células y séllelo.
Llene la cámara exterior del recipiente de reacción con 10 mililitros de la solución de alimentación y ciérrela. Agregue 0,5 microlitros del plásmido de control GFP a las alícuotas de 20 microlitros de la mezcla de reacción. Coloque la reacción en un agitador a 300 rotaciones por minuto durante 18 horas a 30 grados centígrados.
Controle la reacción bajo una luz ultravioleta después de 15 minutos para detectar fluorescencia debido a la síntesis de GFP. Purifique el complejo de nanopartículas MOMP-tNLP de la mezcla de reacción libre de células mediante cromatografía de afinidad de níquel inmovilizada utilizando la etiqueta HIS en la proteína delta-49ApoA1. Transfiera un mililitro de la suspensión al 50 % de la resina de purificación HIS-tag a una columna de cromatografía desechable de 10 mililitros y agregue tres mililitros de tampón aglutinante para equilibrar.
Después, escurre el tampón y añade 250 microlitros de tampón aglutinante a la resina. Extraiga 20 microlitros de la mezcla de reacción libre de células para el análisis SDS-PAGE. Agregue la mezcla de reacción libre de células restante con la resina equilibrada e incube en un balancín de laboratorio durante una hora a cuatro grados centígrados.
Retire la tapa de la columna y lávela con 500 microlitros de tampón aglutinante. Agregue el líquido de lavado a la columna y recoja el flujo para el análisis SDS-PAGE. Lavar la columna con un mililitro de tampón de lavado con 20 milimolares de imidazol seis veces y recoger las fracciones.
Mientras lava por segunda vez, use una pipeta de un mililitro para agitar la resina. Eluir los MOMP-tNLPs en seis fracciones de 300 microlitros de tampón de elución I que contienen 250 milimolares de imidazol y una elución final con 300 microlitros de tampón de elución II que contiene 500 milimolares de imidazol. En la segunda elución, agite vigorosamente la resina pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro.
Utilice un generador de imágenes de gel para capturar las imágenes a 600 nanómetros. A continuación, cuantificar la cantidad de proteínas diferentes en las nanopartículas mediante el análisis SDS-PAGE utilizando un estándar de proteínas. Dibuje una curva estándar utilizando las densidades de las bandas MOMP.
A continuación, determine el componente MOMP de las nanopartículas con el estándar. Resuelva las muestras con SDS-PAGE y transfiera las pilas de gel utilizando un sistema comercial de transferencia seca para el análisis de Western blot. Retire las manchas de la pila e incorpórelas durante la noche a cuatro grados centígrados en un tampón de bloqueo que contenga 0,2% TWEEN 20 y 0,5 microgramos por mililitro MAb40, o 0,2 microgramos por mililitro de anticuerpo antiHIS-tag MAbHIS dirigido contra la etiqueta HIS de la proteína delta-49ApoA1.
Lave cada mancha con PBST tres veces durante cinco minutos por lavado. Incubar las transferencias durante una hora en un tampón de bloqueo que contenga un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo en una dilución de 1:10.000. Repita los lavados con PBST y capture la imagen con un generador de imágenes de fluorescencia después del lavado final.
Usando un aparato de transferencia de puntos, seque tres microgramos de MOMP-tNLP y tNLP vacío. Revele y bloquee las manchas utilizando el mismo método para Western blot. Congele la solución mezclada en hielo seco y liofícela durante la noche con un liofilizador.
Guarde las formulaciones secas a menos 20 grados centígrados. Cuando sea necesario, reconstituya los tNLP liofilizados con agua libre de endotoxinas y enróllelos para disolverlos y rehidratarlos. Diálisis la solución con PBS y elimine la trehalosa con una membrana de diálisis de corte de 3,5 kilodalton.
Centrifugar la solución de nanopartículas en un concentrador de vacío antes de añadir el adyuvante. Controle el volumen de la muestra después de 20 a 30 minutos para evitar que se seque por completo. En una cabina de bioseguridad, agregue el adyuvante en condiciones estériles.
Utilizando cromatografía analítica de exclusión por tamaño, analice la formulación para una incorporación exitosa. Almacene los MOMP-tNLP adyuvados y vacíe los tNLP a cuatro grados centígrados durante un máximo de 14 días. Analizar la estabilidad de la formulación de tNLP con cromatografía de exclusión por tamaño.
El análisis SDS-PAGE de MOMP-tNLP se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad de níquel, lo que demostró que la mezcla de reacción libre de células tiene altos niveles de expresión tanto para la proteína MOMP como para la proteína delta-49ApoA1. Mediante el empleo de densitometría en gel, la concentración de MOMP se cuantificó utilizando un MOMP recombinante purificado con una concentración conocida como estándar. Para determinar la formación de oligómeros, SDS-PAGE MOMP y MOMP-tNLP fueron tratados con calor y DTT, que mostraron bandas distintas para MOMP y delta-49ApoA1.
Se empleó el análisis de Western blot utilizando un anticuerpo MAb40 contra la proteína MOMP, que reveló un patrón de bandas que confirma la formación de oligómeros por la proteína MOMP en su estado no desnaturalizado. Se realizó un ensayo de transferencia de puntos en presencia de anticuerpos MAb40 y MAbHIS, que indicaron la formación de MOMP-tNLP. Sin embargo, la pNLP vacía mostró una señal positiva para MAbHIS.
Los sueros de los ratones inmunizados inyectados con MOMP-tNLP adyuvante demostraron una fuerte unión a MOMP e indicaron que MOMP-tNLP podría provocar una respuesta inmunitaria. Dado que este protocolo genera proteínas a partir del ADN, es esencial evitar contaminar la reacción con la DNasa, la ARNasa, así como el ADN y el ARN extraños. Cualquier material o reactivo utilizado en las reacciones debe estar libre de este tipo de moléculas.
Después de la expresión, purificación y adición de adyuvantes, estas vacunas candidatas pueden evaluarse en modelos animales apropiados para los patógenos de interés para evaluar los marcadores de activación inmunitaria o evaluar la protección durante un desafío. En el caso de la clamidia, la principal proteína de la membrana externa, o MOMP, se ha considerado un antígeno candidato líder para las vacunas de subunidades durante muchos años, pero ha sido difícil producirla a las escalas necesarias para la aplicación de la vacuna. La coexpresión libre de células de esta proteína de membrana es una forma viable de comenzar a mover esta proteína hacia la evaluación en modelos animales como ratones y, finalmente, hacia las pruebas en humanos.
