La centrifugación de sobremesa es un proceso abierto y manual que es difícil de escalar. Nuestro protocolo muestra cómo cerrar y automatizar la disociación, el lavado y la recolección de células madre mesenquimales, o MSC, en una sola ejecución. La configuración es simple.
Todo el proceso se puede realizar fuera del gabinete de bioseguridad en una instalación cGMP de clase. El procesamiento automatizado cerrado de celdas reduce los pasos de manipulación manual que podrían ser propensos a riesgos y permite el cumplimiento de cGMP. Este método se puede aplicar a otros tipos de células expandidas en sistemas de cultivo multicapa.
El sistema de centrifugación de contraflujo permite la modificación de cualquier paso del protocolo para diferentes aplicaciones. Demostrando este procedimiento estará el Dr. Alan Lam, científico del grupo de bioprocesamiento de células madre en el Instituto de Tecnología de Bioprocesamiento, una estrella en Singapur. Para comenzar el ensamblaje del kit de centrifugación de contraflujo de un solo uso, conecte el kit de un solo uso con las bolsas de transferencia de PVC de un solo uso mediante soldadura de tubos, como se describe en la imagen.
A continuación, dentro de un armario de bioseguridad, conecte un matraz multicapa de 10 capas que contenga células madre mesenquimales humanas derivadas de la gelatina de Wharton o HMSC Jelly de Wharton al conjunto de tubos personalizado. Transfiera el recipiente de cultivo de 10 capas adjunto con el conjunto de tubos personalizado a un banco y suéldelo a la línea E del kit de un solo uso. Además. suelde un puerto de muestra estéril a la línea G del kit de un solo uso de alto flujo.
A continuación, conecte la línea de cosecha H a un señuelo estéril, equipado con una jeringa de 50 mililitros. Para configurar el funcionamiento del instrumento, encienda el instrumento con el interruptor de palanca en la parte posterior del instrumento y conecte la computadora portátil al puerto USBC del instrumento con el cable USBC provisto. Ejecute la interfaz gráfica de usuario de Counterflow Centrifuge, o el software GUI desde el escritorio o el menú de inicio e inicie sesión.
A continuación, cargue el protocolo haciendo clic en el botón Seleccionar un protocolo en la página de bienvenida principal. A continuación, presione el botón azul de desbloqueo en el instrumento y abra la puerta de vidrio para cargar el kit de un solo uso ensamblado en el sistema de centrifugación de contraflujo. Comience colgando las bolsas en los ganchos de la percha en un orden que las alinee mejor con los puertos de tubo en las tiras del sensor de burbujas con el matraz multicapa de 10 capas colocado en ángulo.
Alinee el kit con los dos botones de ubicación del kit. Estire el tubo de la bomba alrededor de la bomba peristáltica y presione el conector blanco en forma de bombilla en su lugar. Acople la cámara de centrífuga levantando la palanca de plata del portador de la cámara de centrífuga de contraflujo y asegurándola devolviendo la palanca a su posición vertical.
Presione el tubo de cada puerto del kit en las pistas a lo largo de las tiras del sensor de burbujas. Cierre la puerta presionando el pestillo de la puerta. Presione el botón Iniciar en la GUI.
Aparecerá una lista de comprobación. Los primeros cuatro elementos son verificaciones de instrumentos, mientras que los dos últimos son verificaciones de usuario. En este punto, asegúrese de que las bolsas y las conexiones coincidan con la imagen del kit y que las abrazaderas manuales estén abiertas.
Pulse Confirmar para mostrar la pantalla de entradas de protocolo. Establezca el valor del cuadro de diálogo de entrada de datos o volumen de cosecha como 45 mililitros y presione Confirmar. Presione el botón verde de inicio en el instrumento para iniciar la ejecución del protocolo.
Una vez que se complete el cebado inicial, asegúrese de que el medio gastado se bombee completamente a la bolsa de residuos. En los pasos de pausa indicados en la tabla de flujo de trabajo, levante el matraz multicapa y agítelo para distribuir el búfer por igual a todas las bandejas. Una vez completado, vuelva a colocar el matraz multicapa de 10 capas en su posición de dibujo original para los siguientes pasos.
En los pasos 20 y 23, asegúrese de que las células tripsinizadas se transfieran completamente a la bolsa intermedia. Mezclar bien la bolsa intermedia, manualmente, en el paso 25. En el paso 26, use una jeringa de señuelo de dos mililitros para tomar muestras a través del puerto de muestreo.
En los pasos 29 y 30, verifique la formación estable del lecho celular fluidizado. Debería ser como el lecho celular fluidizado que se muestra aquí. La carrera se completa en el paso de rampa para detenerse, y todos los valores de pellizco en el sistema de centrifugación de contraflujo se cerrarán automáticamente.
Una vez completado el protocolo, presione el botón azul de desbloqueo en el instrumento y abra la puerta de vidrio. Selle asépticamente la línea de cosecha con un sellador de tubo de transporte manual y transfiera cuidadosamente la jeringa sellada llena con la cosecha de células concentrada al gabinete de seguridad biológica para el recuento de células y la criopreservación. Vuelva a separar la cámara con la palanca.
Saque el conector de la bombilla de su accesorio y levante con cuidado el kit y deséchelo en una bolsa de riesgo biológico. Limpie el instrumento con toallitas de etanol y cierre la puerta. Finalmente, cierre primero la aplicación GUI antes de apagar el interruptor en la parte posterior del instrumento.
Las MSC Jelly de Wharton proliferaron bien cuando se expandieron tanto en medios que contienen suero como en medios sin suero y xeno. Sin embargo, aquellos en medio libre de suero y xeno-exhibieron una morfología en forma de huso similar a fibroblastos ligeramente más larga, con un tamaño celular promedio más grande de 17 micras, en comparación con 15 micrones en medio sérico. En ambos medios a lo largo de los tres pasajes, los HMSC de gelatina de Wharton alcanzaron consistentemente una densidad celular máxima de aproximadamente 23.000 células por centímetro cuadrado y un tiempo de duplicación de la población de 34 horas.
Cuando las HMSC Jelly de Wharton se expandieron en recipientes de cultivo de 10 capas utilizando la centrifugación de contraflujo demostrada, se logró una reducción de volumen de diez veces, generando concentraciones celulares de hasta 5,3 millones de células por mililitro. El protocolo logró consistentemente una alta recuperación celular de aproximadamente el 98% y una alta viabilidad celular de aproximadamente el 99% durante tres ejecuciones independientes. Las HMSC de gelatina de Wharton recolectadas con ambos métodos mostraron perfiles característicos de marcadores de superficie que son CD73, CD90 y CD105 positivos, así como CD34 y CD45 negativos.
Las células recolectadas de la centrifugación de contraflujo mostraron un ensayo de fibroblastos de unidad formadora de colonias similar o potencial de UFC, en comparación con las cosechadas por centrifugación manual. En ambos métodos, las células conservaron la capacidad de diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y condrocitos. Los perfiles de secreción de citoquinas de las células después de la centrifugación por contraflujo fueron comparables a la centrifugación previa al contraflujo.
Asegúrese de montar el kit de un solo uso con referencia a la configuración de la cama, desplácelo en este Generador de protocolos del sistema de centrifusión de contraflujo. El protocolo para lavar las impurezas residuales del producto final se puede utilizar en aplicaciones clínicas para ayudar a los usuarios a cumplir con los criterios de liberación de su lote. Para acelerar el proceso de transferencia de fluidos para el procesamiento a gran escala, se pueden usar bombas externas para transferir primero el contenido tripsinizado a una bolsa de transferencia, en lugar de cosechar directamente del matraz de varias capas.
