Este protocolo tiene muchas ventajas sobre la metabolómica de levadura utilizada actualmente porque tiene una alta especificidad, alta sensibilidad y también puede perfilar muchas clases diferentes de metabolitos, incluidas las moléculas isoméricas, isobáricas, hidrófilas e hidrofóbicas. El método de enfriamiento utilizado en este protocolo detiene todas las reacciones enzimáticas mientras reduce significativamente la fuga de metabolitos de las células. La biblioteca MS1 integrada en este protocolo es de las diversas ejecuciones de MS2.
Después del cultivo nocturno a 30 grados Celsius y 200 revoluciones por minuto, determine el número de células de levadura por mililitro de cultivo y agregue cinco mililitros de solución esterilizada de glucosa al 20% a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer que contienen 45 mililitros de medio YP en autoclave por matraz. Use una pipeta de transferencia estéril para agregar cinco veces 10 a la séptima célula de levadura a cada matraz y hacer crecer las células de levadura durante al menos 24 horas adicionales a 30 grados Celsius a 200 revoluciones por minuto. Para la extracción de metabolitos, después del cultivo, recoja las células de levadura por centrifugación y elimine rápidamente el sobrenadante.
Coloque el tubo sobre hielo seco y agregue dos mililitros de cloroformo de menos 20 grados Celsius, un mililitro de metanol de menos 20 grados Celsius, un mililitro de agua nano pura helada y 200 microlitros de perlas de vidrio lavado con ácido de 425 a 600 micras a las células. Cuando se hayan agregado las perlas, coloque el tubo cubierto con papel de aluminio en un kit de soporte de tubo de espuma con un retenedor y vórtice la muestra durante 30 minutos a velocidad media a cuatro grados centígrados para facilitar la extracción de metabolitos. A continuación, incube el tubo durante 15 minutos en hielo antes de centrifugar la muestra para permitir la separación de la fase acuosa superior de los desechos medios y las fases proteicas y orgánicas inferiores.
Use una micropipeta para transferir aproximadamente 400 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo de 1,5 mililitros lavado y etiquetado que contenga 800 microlitros de acetonitrilo de menos 20 grados Celsius. Luego centrifuge la muestra y transfiere 800 microlitros de la parte superior del sobrenadante a un vial de espectrometría de masas marcado para un almacenamiento de cero grados hasta el análisis de espectrometría de masas en tándem por cromatografía líquida. Para separar los metabolitos extraídos, ultrasonice el vial de muestra durante 15 minutos, seguido de tres vórtices de 10 segundos a temperatura ambiente.
Después del vórtice, coloque el vial en la placa del pozo del cromatógrafo líquido y ajuste la columna a 45 grados Celsius con un caudal de 0,25 mililitros por minuto y la placa del pozo a cero grados Celsius. A continuación, utilice la tabla para establecer los gradientes de cromatografía líquida para el análisis. Después de la separación, utilice volúmenes de muestra de 10 microlitros de la inyección en los modos positivo y negativo de ionización por electrospray en un espectrómetro de masas equipado con ionización por electrospray calentada para identificar y cuantificar los metabolitos solubles en agua.
Al final del análisis, abra los datos en bruto en un programa de software de análisis compuesto apropiado y utilice la biblioteca de fragmentación espectral de masas para que coincida con los espectros de masas para anotar los metabolitos identificados en el análisis. Las masas exactas de los patrones de MS1 e isótopos también se pueden identificar para permitir la anotación de los metabolitos utilizando bases de datos en línea. A continuación, utilice la biblioteca de bases de datos y espectros para buscar los espectros MS2 de los datos sin procesar.
Al día siguiente, después de apagar las células de levadura, lave bien las células con 15 mililitros de tampón ABC y recoja las células por centrifugación. Resuspenda el pellet en un mililitro de tampón ABC fresco y agregue 500 microlitros de la solución de yoduro de propidio a las células. Vórtice la muestra tres veces durante 10 segundos por vórtice e incube las células durante 10 minutos en hielo protegido de la luz.
Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y lave las células tres veces con un mililitro de tampón ABC fresco por lavado. Después del último lavado, vuelva a colocar el pellet en 300 microlitros de tampón ABC fresco y agregue 10 microlitros de la suspensión celular resultante a un portaobjetos de microscopio. Utilice un microscopio de fluorescencia para capturar imágenes de contraste de interferencia diferencial y microscopía de fluorescencia de las células con los filtros configurados en una longitud de onda de excitación de 593 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 636 nanómetros.
Luego, use un programa de análisis de imágenes apropiado para contar el número total de células en las imágenes de campo brillante y fluorescencia, y para determinar la intensidad de fluorescencia de la tinción para células individuales. El método de enfriamiento celular modificado causa un daño significativamente menor a la membrana plasmática y la pared celular que el método de enfriamiento de metanol 80% no tamponado a menos 40 grados Celsius. De hecho, casi todas las células sometidas a enfriamiento utilizando el método modificado exhiben emisión de fluorescencia roja, que es característica de las células de levadura en las que la membrana plasmática y la pared celular no están dañadas.
En contraste, casi todas las células sometidas a enfriamiento utilizando el método de metanol 80% no tamponado a 40 grados Celsius mostraron emisión de fluorescencia verde, que es característica de las células de levadura en las que la membrana plasmática y la pared celular están significativamente dañadas. El método de enfriamiento celular modificado también causa una fuga significativamente menor de metabolitos solubles en agua de las células de levadura que el método de enfriamiento sin amortiguación del 80% de metanol a menos 40 grados Celsius. Los valores de desplazamiento de tiempo de retención de los estándares de metabolitos solubles en agua son significativamente más bajos y las formas de pico son sustancialmente más nítidas para la columna de fase zwitteriónica en comparación con la columna de fase inversa.
Otra ventaja del método de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida es la capacidad de utilizar la columna de fase zwitteriónica para separar eficientemente diferentes metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas. Asegúrese de hacer el yoduro de propidio de pie en la oscuridad y también asegúrese de recoger la fase superior sin perturbar la fase media. Si no se puede anotar algún MSP debido a la falta de la biblioteca espectral MS2, use una RMN para ilustrar esta estructura.
