Nuestro protocolo permite a los usuarios medir la actividad de ALDH1A1, un biomarcador de células madre utilizando diversas modalidades que van desde la citometría de flujo hasta las imágenes moleculares de células vivas. Las principales ventajas de este enfoque son que la activación de la sonda implica la respuesta de respuesta caracterizada por una alta relación señal/fondo, así como la detección selectiva de isoformas ALDH1A1. Demostrando este procedimiento estarán Michael Lee, Sarah Gardner y Rodrigo Tapia Hernández estudiantes graduados de mi laboratorio.
Para comenzar, aspire los medios de crecimiento de las células cultivadas de interés en ocho portaobjetos de cámara de pozo. Agregue 500 microlitros por pocillo de medios libres de suero suplementados con una sonda fluorogénica selectiva de dos isoformas micromolares o una sonda de control no reactiva. Incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de la incubación, proceda a la obtención de imágenes con microscopio confocal inmediatamente. Localice las celdas con un aumento de 10x. El canal FITC y los canales de luz transmitida son necesarios para este experimento.
Localice y enfoque las células utilizando el canal de luz transmitida para enfocar en el mismo plano Z durante todo el experimento para eliminar el sesgo. Ajuste la potencia del láser y la ganancia FITC a la configuración adecuada donde la señal de las muestras AlDeSense AM de control sea mínimamente detectable, mientras sigue viendo la señal en las muestras AlDeSense AM. Ajuste cada parámetro deslizando la barra correspondiente.
Es posible que la configuración deba ajustarse varias veces para identificar los parámetros correctos. Una vez optimizado, completa el resto del experimento dentro de esa línea celular usando parámetros idénticos. Tome tres imágenes por pozo para un total de tres pocillos por condición de tratamiento y guarde las imágenes.
Asegúrese de enfocar usando el canal de luz transmitida solo mientras cambia entre planos y pozos para evitar sesgos. A continuación, utilizando el software de procesamiento de imágenes, divida el archivo CZI en diferentes canales y cuente el número total de células y células fluorescentes. Para determinar el porcentaje de células positivas a la aldehído deshidrogenasa 1A1, divida el número de células fluorescentes por el número total de células en cada imagen.
Cuente de la misma manera para cada imagen para evitar variables de confusión. Saque un matraz de cultivo celular T25 que contenga las células mantenidas en la incubadora. Agregue tripsina para el desprendimiento celular y cuente las células usando un contador de células automatizado.
Luego granular las células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros por centrifugación a 180 G durante cinco minutos a 25 grados centígrados. Vuelva a suspender las células en un mililitro de una sonda de dos micromolares o una solución de sonda de control en PBS. Mece las células a temperatura ambiente durante 60 minutos para garantizar una exposición uniforme al tinte.
Después del período de incubación, granular las células por centrifugación a 180 G durante cinco minutos a 25 grados centígrados. Luego vuelva a suspender las celdas en 0.5 mililitros de PBS. Pase las células a través de un colador de células de malla de nylon de 35 micrómetros en un tubo colocado en hielo para eliminar los grupos de células que pueden obstruir el citómetro de flujo.
Encienda el instrumento del citómetro de flujo y ejecute el protocolo de inicio. Compruebe si hay líquido en la vaina y cintura vacía. Ejecute las líneas con 10% de lejía y agua durante cinco minutos cada una.
Luego ejecute perlas de control de calidad para garantizar el funcionamiento correcto. En la pestaña de configuración, seleccione dispersión lateral de dispersión directa y FITC para el filtro de fluorescencia. Dibuje un área de dispersión directa frente a una gráfica de área de dispersión lateral para la población de celdas principales cerca del centro del gráfico.
A continuación, dibuje un área de dispersión hacia adelante, en lugar de un gráfico de ancho de dispersión hacia adelante para las bandas horizontales estrechas que indican singletes. Luego dibuje un área FITC versus un diagrama de área de dispersión hacia adelante para observar la distribución de las células ordenadas por la sonda de encendido fluorogénico selectivo de isoforma. A continuación, dibuje un histograma del área FITC para observar el cambio en la población basado en FITC y determine el porcentaje de células positivas para la aldehído deshidrogenasa 1A1.
Para optimizar la potencia del láser FIFC, ejecute una muestra con la sonda de modo que la cola derecha de la curva del histograma esté cerca de la señal de área máxima de FIFC. El paso de optimización de la potencia del láser puede tener que repetirse varias veces, pero la potencia del láser no debe modificarse en todas las muestras, una vez que se ha designado un ajuste para un experimento. Posteriormente, agregue una muestra al tamiz y ejecútela con la sonda de control.
Un cambio de población debe ser observable para revelar el rango dinámico máximo. Ejecute cada muestra para 10, 000 recuentos realizados por triplicado. Después de completar la recolección de muestras, ejecute las líneas con cloro al 10% y agua durante cinco minutos cada una, luego apague el instrumento.
Procese los datos utilizando software de citometría de flujo y ejerza la población celular deseada. Usando la selección de la compuerta rectangular, establezca la marcha negativa de la aldehído deshidrogenasa 1A1, de modo que más del 99.5% de los eventos en las muestras de la sonda de control ocurran dentro de esta puerta. Las células restantes se considerarán aldehído deshidrogenasa 1A1 positivo.
Aplique las mismas puertas a la muestra de sonda. Cuantificar el número de eventos considerados aldehído deshidrogenasa 1A1 negativo y 1A1 positivo. Se determinaron los encendidos promedio de pliegues para cada línea celular para cuantificar la actividad total de aldehído deshidrogenasa 1A1.
El porcentaje de células positivas de aldehído deshidrogenasa 1A1 se determinó en cada línea celular ajustando la potencia y la ganancia del láser. Para minimizar la señal en la muestra tratada con AlDeSense AM, la señal de fluorescencia se optimizó en las células tratadas con AlDeSense AM. Al contar el número de células positivas para la aldehído deshidrogenasa A1A, se determinó el porcentaje de células positivas para la aldehído deshidrogenasa A1A.
Con la aplicación de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma, la población celular positiva de aldehído deshidrogenasa 1A1 se cuantificó dentro de cada línea celular mediante la activación del 0,5% superior de las células más brillantes dentro de la población de control tratada con AlDeSense AM. El análisis del panel de células de cáncer de ovario ha revelado el porcentaje de células positivas para aldehído deshidrogenasa 1A1. A partir de los resultados obtenidos de las líneas celulares de cáncer probadas, se puede concluir que BG-1 tiene la actividad más baja de aldehído deshidrogenasa 1A1 y la población más baja de aldehído deshidrogenasa 1A1 positiva.
Además, las imágenes confocales y la citometría de flujo revelaron el mayor porcentaje de células positivas para aldehído deshidrogenasa 1A1 en células Caov-3. Pero la actividad general de la línea celular fue solo la tercera más alta. Alternativamente, las células OVCAR-3 contenían la tercera población positiva de aldehído deshidrogenasa 1A1 más alta, pero exhibieron la mayor actividad general.
AlDeSense es una sonda versátil y generalizable para identificar CSCs en líneas celulares inmortalizadas y en muestras de pacientes. Esperamos verlo como una herramienta de pronóstico en el entorno clínico.
