El objetivo de este sencillo sistema biomimético 3D basado en células es facilitar el análisis de la capacidad de invasión en una gran población de esferoides tumorales para el cribado de fármacos antisetásicos. La principal ventaja de nuestra matriz de microcámaras de hidrogel es que permite la producción de un gran número de esferoides uniformes que pueblan el mismo plano focal por pozo. La posición del esferoide se mantiene debido a la estructura de la matriz de microcámaras de hidrogel incluso después de la adición de la matriz extracelular, facilitando el monitoreo continuo preciso de los esferoides y el proceso de invasión.
Además, la caracterización morfológica y la tinción fluorescente de numerosos esferoides y células invasoras se pueden realizar in situ y analizarse a una resolución de un solo elemento de una manera eficiente en el tiempo. La demostración del procedimiento de producción de placas de imágenes de seis pozos de la matriz de microcámaras de hidrogel será Maria Sobolev de nuestro laboratorio. Para preparar las placas de matriz de microcámaras de hidrogel, primero precaliente seis sellos de polidimetilsiloxano, o PDMS, sellos a 70 grados Celsius, y coloque una placa de seis pocillos con fondo de vidrio en un baño seco precalentado a 75 grados Celsius durante varios minutos.
Cuando la placa esté caliente, vierta una gota de 400 microlitros de agarosa precalentada de baja fusión en la parte inferior de cada pozo de la placa de seis pozos, y coloque suavemente un sello sobre cada gota. Deje que la configuración se enfríe durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 20 minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación completa de la agarosa. Cuando la agarosa se haya solidificado, despegue suavemente el PDMS de cada pozo, dejando los geles de agarosa estampados con microcámaras.
Después de permitir que la lámpara UV alcance su mayor intensidad, coloque la placa en relieve en el sistema de curado de luz durante tres minutos, y llene los macro-pozos esterilizados por UV con PBS estéril. A continuación, cubra la placa y envuélvala con Parafilm para un almacenamiento Celsius de cuatro grados hasta su uso. Para cargar las células, retire el PBS de cada pozo y cargue suavemente 50 microlitros de las células de interés encima de cada matriz de hidrogeles.
Después de permitir que las células se asienten por gravedad durante 15 minutos, agregue cuidadosamente seis a ocho alícuotas de 500 microlitros de medio fresco al borde del fondo plástico macro-pozo fuera de la matriz de anillo e hidrogel. Incubar las células durante el período de tiempo adecuado a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono con humedad para la formación de esferoides. Luego, transfiera los esferoides a una capucha de bioseguridad sobre hielo durante 10 minutos.
Cuando la placa se haya enfriado, incline una punta de pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo junto a la matriz de hidrogeles, y retire todo el medio de alrededor de la matriz. A continuación, retire el medio del tanque de la matriz, incline una punta de pipeta de carga de gel en el borde del tanque de la matriz con mucho cuidado, teniendo cuidado de no molestar a las microcámaras y esferoides. A continuación, utilice una punta de pipeta fina precongelado para agregar dos alícuotas de 150 microlitros de la mezcla de colágeno de interés en el borde de la matriz de una en una, liberando la mezcla lentamente para evitar la luxación de esferoides.
Después de que se haya añadido la segunda ronda de colágeno a cada pozo, devuelva los esferoides a la incubadora durante una hora para la gelación completa de la matriz extracelular. Cuando la matriz se haya solidificado, agregue 400 microlitros de agarosa precalegada al 1% de baja fusión en la parte superior del gel, e incubar la placa, cubierta a temperatura ambiente, durante cinco a siete minutos, antes de enfriar durante dos minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación. A continuación, inclinando la pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo, añadir suavemente dos mililitros de medio completo a cada pozo.
Para realizar un ensayo de invasión, cargue la placa de matriz de microcámara de hidrogel en una etapa de microscopio invertido motorizado equipada con una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono con una atmósfera humidificada, y utilice un objetivo de cuatro o 10x para pre-determinar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada pozo de modo que se evalúe toda el área de la matriz. Luego, adquiera imágenes de campo brillante cada dos o cuatro horas para un total de 24 a 72 horas para rastrear la invasión celular desde el cuerpo esferoide en la matriz extracelular circundante. Al final de la adquisición de imágenes, exporte las imágenes de lapso de tiempo desde el software de adquisición de imágenes para guardar en un formato de archivo de imagen etiquetado a una carpeta dedicada.
A continuación, abra la interfaz gráfica de usuario y haga clic en Cargar campo brillante. Ajuste los parámetros de segmentación de la imagen para lograr una segmentación precisa de los esferoides y sus áreas de invasión, y haga clic en Segmentación de región de interés para crear un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse Suprimir o Agregar y realice las correcciones adecuadas manualmente.
Haga clic en Seguimiento para numerar los esferoides en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. A continuación, haga clic en Medición para generar una hoja de cálculo con todos los parámetros y guarde la hoja de cálculo en un formato adecuado para el procesamiento de datos y el análisis estadístico. Para examinar la influencia del ácido hialurónico en el proceso espontáneo de invasión de esferoides HeLa, en este experimento, los esferoides maduros de dos días se cubrieron con solución de colágeno y mezcla de ácido hialurónico y se compararon con esferoides maduros de dos días cubiertos con solución de colágeno solo.
Después de 50 horas de incubación, los esferoides incrustados en colágeno y ácido hialurónico demostraron una dispersión celular inferior en la matriz extracelular circundante en comparación con los esferoides incrustados solo en colágeno. De hecho, el análisis de la cinética del área de invasión a lo largo del tiempo para 99 esferoides con una resolución de un solo esferoide indica claramente que la adición de ácido hialurónico al colágeno inhibe la dispersión celular fuera del esferoides, lo que resulta en áreas de invasión más pequeñas. El tratamiento del cultivo de esferoide HeLa con un flavonoide bioactivo con propiedades cito-y migratorias durante 24 horas da como resultado una dispersión celular inhibida alrededor de los esferoides en comparación con los esferoides HeLa no tratados.
De hecho, el análisis de las áreas de invasión de 488 esferoides al final del experimento reveló una inhibición significativa después del tratamiento con tan poco como 10 micromolares de la droga. Debido a la baja fijación característica del hidrogel, esta tecnología basada en microcámaras facilita la formación de esferoides incluso en casos de muy pocas células. Esto es especialmente ventajoso en valiosas muestras limitadas de células primarias similares a tallos o derivados del paciente.
La placa de imágenes de microcámara de hidrogel permite el análisis de la ubicación espacial exacta de los esferoides durante experimentos a largo plazo para la evaluación del proceso de invasión a nivel de un solo elemento y proporciona un alto grado de robustez estadística y precisión. Las aplicaciones futuras de esta metodología incluyen el cultivo unicelular en paralelo de células tumorales y estromales en diferentes regiones dentro del macro-pozo y la recuperación de esferoides individuales para el análisis molecular aguas abajo.
