Este es un método hidropónico no invasivo para medir la arquitectura del sistema radicular utilizando equipos de laboratorio de rutina. Este protocolo permite la visualización completa de todo el sistema radicular de la planta extendiéndolo manualmente. Una de las principales ventajas del análisis RSA es que permite estudiar el sistema radicular de las plantas sin necesidad de que pueda introducir contaminación elemental no deseada.
Este método puede registrar la interacción ambiental directa, incluidas las condiciones hormonales, nutricionales y climáticas, con el RSA de los sistemas vegetales. Comience la esterilización superficial de las semillas de Arabidopsis remojando una pequeña cucharada de aproximadamente 100 semillas en agua destilada a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, centrifugar brevemente las semillas a 500 G durante cinco segundos con una centrífuga de mesa.
A continuación, decantar el agua y agregar 700 microlitros de etanol al 70% antes de enrojecer el tubo durante unos segundos. Centrifuga las semillas de nuevo. Si es necesario, repita el vórtice y la centrifugación, asegurándose de que el tratamiento con etanol al 70% no exceda los tres minutos.
Después de tres minutos, enjuague inmediatamente las semillas con agua estéril. A continuación, trate las semillas con lejía comercial diluida que contenga una gota de TWEEN 20 durante siete minutos. Mezcle las semillas con una solución de lejía invirtiendo los tubos rápidamente de ocho a 12 veces.
Después de una breve centrifugación, decantar el sobrenadante con una pipeta de un mililitro y enjuagar las semillas al menos cinco veces con agua estéril, siguiendo el mismo procedimiento de vórtice. Deje las semillas esterilizadas en la superficie en agua e incubarlas durante dos o tres días a cuatro grados centígrados para la estratificación. Autoclave la caja magenta estándar medio llena de agua destilada.
Corte la lámina de policarbonato esterilizada en autoclave en rectángulos de cuatro por ocho centímetros con un punto medio con muescas a más de la mitad del rectángulo para que dos rectángulos puedan encajar juntos para formar una forma de X. Utilice esta configuración para sostener la malla de polipropileno de 250 micrómetros de tamaño de poro cortada en cuadrados de seis por seis centímetros. En el gabinete de flujo de aire laminar, agregue medios basales semi MS estériles con vitaminas más 1.5% de sacarosa a cada caja para llegar al borde inferior de la malla de polipropileno.
Siembre las semillas esterilizadas en la superficie en la malla hidropónicamente y agrézcalas durante tres días. Después de tres días, transfiera las plántulas a una malla de tamaño de poro de 500 micrómetros y déjelas crecer durante dos días. A continuación, transfiera las plántulas a los medios de control y a los medios experimentales, y deje que las semillas crezcan durante siete días.
Agregue de 10 a 20 mililitros de agua del grifo filtrada en autoclave a la placa de Petri. Saque suavemente las plántulas de la malla de 500 micrómetros. Con la ayuda de un pincel de arte redondo, extienda raíces similares a plantas en la placa llena de agua y sumérjalas en agua.
Incline la placa ligeramente para eliminar el agua. Escanee o fotografíe estas placas de Petri apropiadamente. Mida la arquitectura del sistema raíz, o rasgos RSA, utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente, luego abra el archivo que se va a analizar.
Después de definir la escala, utilice la herramienta de línea recta para crear una selección de línea que delinee la barra de escala. Termine de delinear haciendo clic con el botón derecho, haciendo doble clic o haciendo clic en el cuadro al principio. Para medir la longitud de la barra de escala conocida en píxeles, haga clic en analizar, seguido de medir en la barra de herramientas.
Anota la longitud del píxel. Abra el cuadro de diálogo Establecer escala haciendo clic en la pestaña Establecer escala en la pestaña Analizar. Compruebe la longitud de píxeles en el campo de distancia en píxeles.
A continuación, introduzca el valor de la barra de escala en el campo de distancia conocida y establezca la unidad de longitud como milímetros. Bloquee la escala para esta imagen en particular haciendo clic en Aceptar. Utilice la herramienta de línea segmentada para una selección de línea que delinee la longitud de la raíz.
Después de terminar el esquema, ajuste la selección de línea haciendo clic y arrastrando los pequeños controladores en blanco y negro a lo largo del contorno. En la pestaña analizar de ImageJ, seleccione el comando measure y cuantifique la longitud de la raíz. Transfiera los datos medidos a una hoja de cálculo haciendo clic derecho en la ventana de resultados, seleccionando copiar todo en el menú emergente, cambiando a la hoja de cálculo y pegando los datos.
Para la medición y el cálculo de los rasgos RSA, mida la longitud de la raíz primaria entre la unión hipocótilo y el extremo de las puntas de la raíz. Luego mida las raíces laterales de primer orden, o la longitud de un grado LR, y las raíces laterales de segundo orden, o la longitud de LR de dos grados. Una vez hecho esto, copie y pegue todas las mediciones en la hoja de cálculo.
Mida y registre la zona de ramificación de la raíz primaria, o BZPR, que abarca desde el primer punto emergente de la raíz lateral hasta el último punto emergente de la raíz lateral. Del mismo modo, registre el número de raíces laterales que se originan dentro del límite del BZPR. A continuación, mida la longitud promedio de las raíces laterales de primer y mayor orden.
Deriva la longitud promedio de las raíces laterales primarias dividiendo la longitud total de las raíces laterales primarias por el número total de raíces laterales primarias. Luego, para medir la longitud promedio de las raíces laterales de segundo orden, calcule la longitud promedio de las raíces laterales secundarias dividiendo la longitud total de las raíces laterales secundarias por el número total de raíces laterales secundarias. Mida la densidad de la raíz lateral primaria dividiendo el número de raíces laterales primarias por la longitud del BZPR.
A continuación, mida la zona de ramificación de las raíces laterales individuales y calcule la densidad de la raíz lateral secundaria dividiendo el número de raíces laterales secundarias por la longitud de las zonas de ramificación de las longitudes de las raíces laterales de segundo orden. Una vez hecho esto, mida la longitud total de la raíz, o TRL. Este es el agregado de raíces primarias y longitudes de raíces laterales primarias y secundarias.
El sistema hidropónico utilizado en este experimento funcionó bien, reflejando el fenotipo contrastante aparente bajo condiciones deficientes y suficientes de fosfato inorgánico. Se analizaron varios rasgos de RSA bajo regímenes de fosfato inorgánico contrastantes en condiciones hidropónicas. El tratamiento deficiente en fosfato inorgánico invocó un fenotipo radicular que exhibía un RSA más corto, menos profundo y menos ramificado, en comparación con la condición suficiente de fosfato inorgánico.
La longitud de la raíz primaria se atenuó significativamente bajo la condición deficiente de fosfato inorgánico. La ganancia significativa y rápida en la longitud de la raíz primaria en presencia de fosfato inorgánico milimolar 1,25 o medios de control indicó la eficiencia del sistema hidropónico y reflejó adecuadamente los cambios fisiomorfológicos. La zona de ramificación se redujo significativamente bajo la condición deficiente de fosfato inorgánico.
La longitud promedio de la raíz lateral primaria se redujo significativamente en la condición de deficiencia de pi. La longitud promedio de la raíz lateral secundaria se redujo de manera similar debido a la condición deficiente en fosfato, sin embargo, fue menor en cantidad que la longitud promedio de la raíz lateral primaria. El número de raíces laterales primarias y secundarias disminuyó fuertemente bajo la condición deficiente de fosfato, en comparación con la condición de fosfato inorgánico de 1,25 milimolares de control.
La densidad de la raíz lateral primaria no se modificó bajo la condición deficiente en fosfato, en relación con la condición de fosfato inorgánico milimolar de control, 1,25 milimolar. La densidad de la raíz lateral secundaria no mostró ningún cambio significativo, lo que indica la importancia de la densidad de la raíz lateral para obtener información sobre la plasticidad RSA. Quité suavemente las plántulas de la malla con pinzas.
Extiendo raíces en un plato lleno de agua usando un pincel redondo, todas las raíces primarias, y lo extiendo recto, extendiendo raíces laterales simétricamente, extendiendo raíces laterales de segundo orden unidas a raíces laterales de primer orden. Se puede utilizar un método similar para calcular el área de hollín de las puntas de plantas de Arabidopsis. Las hojas de Arabidopsis se pueden extender en la otra placa seguida de la captura de imágenes y el análisis utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente para determinar el área de hollín.
Este protocolo se puede utilizar para responder a cualquier pregunta sobre la influencia del medio ambiente en la plasticidad del sistema radicular.
